水稻葉片衰老特異性啟動(dòng)子的克隆和利用及劍葉早期衰老上升表達(dá)基因的鑒定.pdf

1、水稻是人類最重要的糧食作物之一。雖然目前雜交水稻的推廣很大程度上解決了世界人民的糧食問(wèn)題，但是一些優(yōu)良品種尤其是一些秈型品種在中后期衰老快，限制了更多有機(jī)物的形成和積累，不利于結(jié)實(shí)率和千粒重等產(chǎn)量相關(guān)性狀的提高。解決這個(gè)問(wèn)題的關(guān)鍵是了解葉片衰老的機(jī)制，創(chuàng)造延緩水稻葉片衰老的途徑，進(jìn)而提高有機(jī)物在籽粒中的積累。利用衰老特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)細(xì)胞分裂素基因表達(dá)、抑制衰老上升基因表達(dá)或者過(guò)量表達(dá)衰老下降基因都有可能實(shí)現(xiàn)持綠性水稻的目標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)這

2、個(gè)問(wèn)題，克隆鑒定了水稻來(lái)源的衰老特異性啟動(dòng)子，并用該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)農(nóng)桿菌來(lái)源的細(xì)胞分裂素合成酶基因轉(zhuǎn)化秈稻和粳稻，篩選持綠性家系，并且構(gòu)建了中花11劍葉的早期衰老上升表達(dá)文庫(kù)，主要結(jié)果如下： 1.克隆水稻啟動(dòng)子PSAG39，通過(guò)報(bào)告基因GUS融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻鑒定其時(shí)空組織特異性表達(dá)譜。經(jīng)過(guò)組織化學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)其在葉、莖、根、花、穎殼及未成熟種子的種皮、愈傷組織中表達(dá)，在成熟種子及胚乳中不表達(dá)，而且在葉片衰老晚期表達(dá)量達(dá)到高峰，揭示該

3、啟動(dòng)子是葉片衰老特異性，而且可以應(yīng)用于基因工程育種改良研究。 2.鑒于啟動(dòng)子序列預(yù)測(cè)出多種激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用位點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)用瞬時(shí)表達(dá)體系檢測(cè)激素和冷脅迫對(duì)一系列5’端缺失啟動(dòng)子的表達(dá)情況，并且研究了缺失啟動(dòng)子的衰老特異性表達(dá)譜，確定PSAG39啟動(dòng)子的衰老相關(guān)的順式作用位點(diǎn)存在的區(qū)段。通過(guò)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)鑒定了可能對(duì)衰老上升表達(dá)起作用的順式因子。揭示順式作用位點(diǎn)HBOXCONSENSUSPVCHS和WRKY710S與葉片衰老特異表

4、達(dá)有關(guān)。 3.在粳稻中成功轉(zhuǎn)化了PSAG39:IPT表達(dá)系統(tǒng)，繁殖并篩選了單拷貝插入的轉(zhuǎn)基因純合家系，5個(gè)以牡丹江8＃為受體：MT1、MT2、MT3、MT4、MT5；3個(gè)以中花11為受體：ZT1、ZT2、ZT3。 4.研究轉(zhuǎn)PSAG39:IPT表達(dá)系統(tǒng)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻的葉片持綠性變化，發(fā)現(xiàn)持綠性增強(qiáng)，且這個(gè)表型與外源基因IPT的表達(dá)量共分離。 5.調(diào)查了轉(zhuǎn)化植株表達(dá)的細(xì)胞分裂素在光照下對(duì)幼苗生長(zhǎng)及抽穗期產(chǎn)生的影響

5、，PSAG39:IPT的轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)細(xì)胞分裂素在一定光照條件下(14小時(shí)或24小時(shí))影響了種子剛萌發(fā)時(shí)芽的生長(zhǎng)，但是不會(huì)影響莖桿的繼續(xù)伸長(zhǎng)。在長(zhǎng)日照條件下，轉(zhuǎn)基因中花11植株表達(dá)細(xì)胞分裂素刺激了OsMADS50的表達(dá)，從而提前開(kāi)花。 6.探明結(jié)實(shí)期間碳氮代謝水平是否發(fā)生變化，通過(guò)分析純合家系ZT1可溶性糖含量和全氮含量發(fā)現(xiàn)，糖及氮素水平的改變引起葉片的庫(kù)源轉(zhuǎn)換發(fā)生變化從而引發(fā)葉片衰老。 7.完成純合家系的隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，

6、每個(gè)小區(qū)設(shè)置三個(gè)重復(fù)，調(diào)查轉(zhuǎn)基因植株的持綠性和其他農(nóng)藝性狀。轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系ZT1、ZT2的生物學(xué)產(chǎn)量相對(duì)其陰性株系降低約8-10％，千粒重增加約5-9％。 8.以綠色葉片為driver，早期衰老葉片為tester，用抑制差減雜交法完成水稻劍葉早期衰老特異基因文庫(kù)的構(gòu)建，以driver和tester的總RNA為探針?lè)謩e進(jìn)行文庫(kù)克隆的Macroarray雜交，篩選出815個(gè)差異表達(dá)的ESTs。通過(guò)生物信息學(xué)分析(陽(yáng)性克隆聚類及GO分

7、析)，一共確定了533個(gè)單基因，其中183個(gè)有GO注釋，涉及大分子物質(zhì)代謝、調(diào)控蛋白質(zhì)合成、能量代謝、調(diào)節(jié)基因、解毒、病原性和逆境、細(xì)胞骨架構(gòu)成和花發(fā)育。121個(gè)與已報(bào)導(dǎo)過(guò)的持綠相關(guān)QTLs共線性，其余是功能未知的新基因。 9.從文庫(kù)中隨機(jī)挑選50個(gè)陽(yáng)性克隆的Northern雜交驗(yàn)證了差減雜交的效率和準(zhǔn)確度，達(dá)到60％以上。對(duì)幾個(gè)未知功能的基因進(jìn)行定量PCR實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)它們不僅在自然衰老早期上升表達(dá)，而且不同程度的受到激素的誘導(dǎo)。