用全長(zhǎng)基因?qū)ぐ屑夹g(shù)篩選靶向pai1+mrna的反義核酸及sirna

1、中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士后學(xué)位論文用全長(zhǎng)基因?qū)ぐ屑夹g(shù)篩選靶向PAI1mRNA的反義核酸及siRNA姓名：楊長(zhǎng)春申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士后專業(yè)：藥物分析學(xué)指導(dǎo)教師：王升啟20050801首先應(yīng)用R1：PcR方法克隆PAIl全長(zhǎng)基因，體外轉(zhuǎn)錄大量mRNA：將合成的單鏈寡核苷酸庫(kù)與mRNA進(jìn)行雜交，經(jīng)洗脫、PcR擴(kuò)增、克隆及測(cè)序獲得一系列與靶基因結(jié)合的位點(diǎn)在對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，找到與靶基因的熱點(diǎn)結(jié)合部位：根據(jù)這些熱點(diǎn)結(jié)合部

2、位設(shè)計(jì)探針21條，在基因芯片上進(jìn)行再篩選和優(yōu)化：綜合篩庫(kù)和芯片雜交結(jié)果，合成15條硫代修飾的反義寡核苷酸，在細(xì)胞水平進(jìn)行驗(yàn)證。以脂質(zhì)體將其分別轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HuvEc)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后48k在反義核酸濃度為1o洲幾時(shí)，15條反義序列中有】4條(93％)能明顯降低PAI1Ag水平(，(O05)。在此基礎(chǔ)上，我們挑選5條作用明顯的有效序列(4#、5#、御、8#、lo#AsODN)進(jìn)一步研究表明，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反義核酸濃度在o

3、1，025。05，10“M幾時(shí)，該s條ASODN可有效抑制PAI1mRNA表達(dá)、Ag水平及活性，且呈劑量依賴性。上述結(jié)果提示，應(yīng)用全長(zhǎng)基因?qū)ぐ屑夹g(shù)可以同時(shí)在全長(zhǎng)基因范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)熱點(diǎn)靶位，而且理論上，遺漏最佳位點(diǎn)的可能性小，實(shí)現(xiàn)了對(duì)AsoDN最佳結(jié)合位點(diǎn)的高通量篩選；靶向PAI一1mRNA的AsODN可通過(guò)抑制PAI1mRNA翻譯成蛋白質(zhì)而降低了Pc~I1A疊水平和活性，該作用機(jī)制與傳統(tǒng)的溶栓藥物及目前從蛋自水平抑制PAI1的溶栓藥物作用機(jī)

4、制有根本不同，因此有望成為心血管疾病特別是血栓性疾病治療的一種新型侯選溶栓反義藥物。2靶向PAI1mRNAsiRNA有效序列的篩選與細(xì)胞學(xué)驗(yàn)證通過(guò)全長(zhǎng)基因?qū)ぐ屑夹g(shù)，獲得了5條反義有效序列。在此基礎(chǔ)上，合成2條(5#、10#)有潛在高活性的與靶mRNA互補(bǔ)的蚶ⅢA，與載體連接構(gòu)建siRNA表達(dá)質(zhì)粒，應(yīng)用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HUVEc，觀察siRNA對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞PAI1mRNA表達(dá)、Ag水平和活性的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sjRN

5、A對(duì)PAI一】mRNA表達(dá)、Ag和活性有明顯的抑制作閣。PA一siRNA濃度在1p∥ml，2“g，ml，4p咖1范圍內(nèi)，可有效抑制PAI一1lnRNA，Ag表達(dá)及活性，呈劑量依賴性。上述結(jié)果提示，應(yīng)用全長(zhǎng)基因?qū)ぐ屑夹g(shù)篩選出的反義位點(diǎn)設(shè)計(jì)的反義寡核苷酸(As0DN)的最佳結(jié)合位點(diǎn)與siRNA的作用位點(diǎn)有很好的相關(guān)性，反義寡核苷酸(AsoDN)的最佳結(jié)合位點(diǎn)可能就是高活性siRNA的作用位點(diǎn)；本課題設(shè)計(jì)的siRNA不僅與PAI1mRNA的堿

6、基互補(bǔ)，而且是經(jīng)過(guò)最佳反義結(jié)合位點(diǎn)的篩選進(jìn)行定向設(shè)計(jì)的，其特異性和有效性是預(yù)測(cè)的；靶向P_AI1siRNA有效序列對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞PAI1表達(dá)和活性有明顯的抑制作用，其機(jī)制與高效、特異引起轉(zhuǎn)錄后PAI1基因沉默有關(guān)：與現(xiàn)有的基因治療藥物相比，siRNA具有治療理論新穎、藥效特異、作用時(shí)間長(zhǎng)等特色，并且siRNA為內(nèi)源性活性物質(zhì)，安全性好，靶向PAIIsiRNA有效序列有望成為新型溶栓基因藥物。綜述Il上工作，通過(guò)全長(zhǎng)基因?qū)ぐ屑夹g(shù)，篩選出5