磷酸二酯酶催化水解機(jī)理及其抑制劑噠嗪酮衍生物糖苷化機(jī)理的理論研究.pdf

1、磷酸二酯酶(PDE)一系列的同工酶作為第二信使3’，5’-環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和3’，5’-環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)唯一的水解代謝酶，在生物體內(nèi)對控制環(huán)磷酸核苷的濃度，細(xì)胞內(nèi)外信息傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)生命活動等起著舉足輕重的作用。以磷酸二酯酶作為藥物靶點，尋找新型抑制劑的研究也已經(jīng)廣泛開展起來，而對于PDE催化水解的機(jī)理探索正是這些研究的基礎(chǔ)。目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動物體內(nèi)有11類磷酸二酯酶，他們的活性區(qū)域都有十分相似的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)，因此其催化水

2、解機(jī)理也應(yīng)該是相似的。相關(guān)的文獻(xiàn)報道以磷酸二酯酶的X射線晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，提出磷酸二酯酶的催化水解是以二價雙金屬離子為中心，由氫氧根離子作為水解反應(yīng)的親核試劑，環(huán)磷酸核苷O3’原子附近的組氨酸作為質(zhì)子供體，完成催化水解反應(yīng)。然而酶的活性區(qū)域的結(jié)構(gòu)在催化反應(yīng)前后應(yīng)該是不同的，用晶體結(jié)構(gòu)代替PDE結(jié)合底物時的結(jié)構(gòu)來分析催化水解的機(jī)理得到的結(jié)果并不合理。
　　 本文用選取3種磷酸二酯酶結(jié)構(gòu)PDE4d2(PDB ID：1PTW)、PDE5

3、a(PDB ID：1T9S)和PDE10a(PDB ID：20UQ)，采用分子對接、分子動力學(xué)模擬的方法，得到磷酸二酯酶與環(huán)磷酸核苷結(jié)合的活性區(qū)域結(jié)構(gòu)，并經(jīng)過統(tǒng)計分析建立量化計算模型，找到了新的PDE催化水解的機(jī)理：1)環(huán)磷酸核苷(底物)進(jìn)入PDE的活性區(qū)域，與雙金屬結(jié)構(gòu)作用；2)結(jié)合在金屬離子上的HO-進(jìn)攻環(huán)磷酸基團(tuán)上的P原子引發(fā)水解反應(yīng)，同時聚集在O3’原子附近的水分子提供一個質(zhì)子給O3’原子，幫助O3’-P鍵斷裂；3)水解反應(yīng)結(jié)束

4、，產(chǎn)物離開活性區(qū)域，提供質(zhì)子的水分子變成新的HO-，并結(jié)合金屬離子等待下一個底物進(jìn)入進(jìn)行下一個催化循環(huán)。通過分析殘基與底物的距離以及水分子的空間分布函數(shù)，作者認(rèn)為并不是靠近底物的組氨酸提供質(zhì)子給環(huán)磷酸核苷促進(jìn)O3’-P鍵斷裂，而是水分子直接提供質(zhì)子。磷酸二酯酶作為cAMP和cGMP的催化水解酶，使底物以一定構(gòu)象結(jié)合在水解區(qū)域，而組成活性區(qū)域的殘基為水解反應(yīng)提供了合適的環(huán)境促使環(huán)磷酸核苷發(fā)生選擇性水解反應(yīng)。相關(guān)的計算結(jié)果已經(jīng)于2011年1

5、0月28被Journal of Theoretical and Computational Chemistry收錄。
　　 PDE抑制劑一直以來都是藥物研發(fā)的重要領(lǐng)域。噠嗪酮類化合物不僅可以作為磷酸二酯酶抑制劑，還具有其它廣泛的藥用價值，例如抗癌活性，消炎作用等等。將糖基引入具有藥用價值的化合物是新藥篩選、改良已有藥物藥性常用手段。本文研究了在實驗室合成鹵代苯基噠嗪酮糖苷過程中曾經(jīng)遇到產(chǎn)物難以控制的問題，解釋了糖苷化的反應(yīng)機(jī)理，

6、找到了得到不同糖苷產(chǎn)物的原因，為實驗室合成類似糖苷提供了理論指導(dǎo)。
　　 實驗室合成糖苷使用兩種方法，Koenigs-Knorr反應(yīng)和相轉(zhuǎn)移催化法都遵循SN2反應(yīng)過程。得到的兩種產(chǎn)物，鹵代苯基噠嗪酮氧苷和氮苷分別為動力學(xué)產(chǎn)物與熱力學(xué)產(chǎn)物，且兩種產(chǎn)物可以相互轉(zhuǎn)化。在Koenigs-Knorr反應(yīng)中，銀離子對于得到氧苷產(chǎn)物有重要的作用。相關(guān)計算結(jié)果發(fā)表在Computational and theoretical Chemistry，

7、963(2011)119-124。
　　 5-氟尿嘧啶及其衍生物是廣泛應(yīng)用于臨床的抗腫瘤藥物，將其與糖基結(jié)合生成糖苷可能降低其副作用，提高藥效。本文研究了實驗室采用相轉(zhuǎn)移催化法和Koenigs-Knorr反應(yīng)合成2-苯氧基-5-氟尿嘧啶和2-苯硫基-5-氟尿嘧啶氮苷、氧苷的反應(yīng)機(jī)理。計算結(jié)果表明兩種方法的糖苷化反應(yīng)均為SN2反應(yīng)過程。使用相轉(zhuǎn)移催化法，兩種5-氟尿嘧啶衍生物生成氮苷需要克服的能壘明顯低于氧苷，這一點與實驗中主要得

8、到氮苷產(chǎn)物相吻合。銀離子在使用Koenigs-Knorr反應(yīng)制備氧苷產(chǎn)物的過程中起到結(jié)合溴離子，引發(fā)取代反應(yīng)以及絡(luò)合N原子確定氧苷形成的作用。
　　 本文的主要創(chuàng)新點有：1.根據(jù)不同PDE的結(jié)構(gòu)，利用分子對接和分子動力學(xué)模擬的方法建立量化計算模型來討論催化水解機(jī)理，而不是直接采用PDE的X射線晶體結(jié)構(gòu)分析水解機(jī)理。2.提出了新的磷酸二酯酶的催化水解機(jī)理，并綜合考慮水分子作為溶劑在水解反應(yīng)中的作用。3.在實驗的基礎(chǔ)上討論了噠嗪酮衍