miR-101和miR-125a-5P在LPS誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞自噬過(guò)程中的作用.pdf

1、【研究背景】膿毒癥（ sepsis）是一種感染所致的全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），由于容易合并多器官衰竭（MOF），病死率高，是重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）非心血管疾病的主要死亡原因之一。膿毒癥的病理生理機(jī)制異常復(fù)雜，主要涉及炎癥的激活、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、微循環(huán)障礙、凝血功能障礙、免疫抑制、細(xì)胞凋亡、基因多態(tài)性、神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)控紊亂等一系列問(wèn)題，但具體機(jī)制仍不明確。新近的研究表明，細(xì)胞自噬（autophagy）也參與了膿毒癥的發(fā)病，細(xì)胞自

2、噬在膿毒癥中被激活，通過(guò)維持細(xì)胞內(nèi)平衡、限制細(xì)胞損傷和死亡而起保護(hù)作用。然而，當(dāng)細(xì)胞自噬過(guò)度激活時(shí)，不一定對(duì)病原體感染的細(xì)胞起保護(hù)作用，既往細(xì)胞實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，自噬機(jī)制會(huì)為入侵的細(xì)菌最初的存活和繁殖提供條件。但是細(xì)胞自噬在膿毒癥中所起的作用仍不明確，有待進(jìn)一步探索。微小核糖核酸（miRNAs）也參與了免疫細(xì)胞功能和細(xì)胞自噬的調(diào)控。有研究表明選用脂多糖（LPS）在體外刺激巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞的應(yīng)答是通過(guò)調(diào)控miRNAs中的let-7e、miR-

3、181c、miR-155和miR-125b的表達(dá)而完成的。研究表明體外培養(yǎng)的肺泡巨噬細(xì)胞株受LPS刺激后，miR-146a在巨噬細(xì)胞株中表達(dá)增高。前期研究也證實(shí)，miR-129和miR-142-3p參與調(diào)控THP-1細(xì)胞的炎癥/自噬水平。通過(guò)生物信息學(xué)軟件比對(duì)，篩選出miR-101和miR-125a-5p，這兩個(gè)miRNAs可能靶向作用于自噬相關(guān)基因4D（ATG4D），而后者是自噬過(guò)程中的一個(gè)重要分子。因此，通過(guò)體外培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，

4、經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化為T(mén)HP-1巨噬細(xì)胞后，用LPS刺激THP-1巨噬細(xì)胞建立細(xì)胞模型，采用轉(zhuǎn)染的方法在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-101和miR-125a-5p，檢測(cè)相應(yīng)的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)變化，探討這兩個(gè)miRNAs對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬的調(diào)控作用。
　　【研究目的】證明miR-101、miR-125a-5p對(duì)LPS誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞自噬過(guò)程中的調(diào)控作用。
　　【研究方法】
　　1. THP-1細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代、凍存，以及TH

5、P-1巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)。
　　2.采用不同濃度（0ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml）LPS處理THP-1巨噬細(xì)胞12小時(shí)后，利用MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力水平，利用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、MCP-1水平，利用蛋白免疫印記技術(shù)（ Western blot）檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白( LC3II、Beclin1、ATG4D)的表達(dá)變化。
　　3.采用LPS500ng

6、/ml處理THP-1巨噬細(xì)胞12小時(shí)后，通過(guò)定量PCR檢測(cè)miR-101、miR-125a-5p表達(dá)的情況。
　　4.轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體 lipofectamine RNAiMAX介導(dǎo) miRNA模擬物（miRNA-mimic）轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4小時(shí)后，通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)miRNA-mimic的轉(zhuǎn)染效率。
　　5.轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞24小時(shí)后，LPS500ng/ml處理THP-1巨噬細(xì)胞12小時(shí)后，利用蛋白免疫印

7、記技術(shù)（Western blot）檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白( LC3II、Beclin1、ATG4D)的表達(dá)變化情況。
　　【結(jié)果】
　　1. LPS刺激THP-1巨噬細(xì)胞后炎癥因子的釋放情況：LPS刺激THP-1巨噬細(xì)胞12小時(shí)后TNF-α、MCP-1釋放水平較空白對(duì)照組均顯著上升。
　　2. LPS刺激THP-1巨噬細(xì)胞后自噬相關(guān)蛋白的變化：LPS刺激THP-1巨噬細(xì)胞12小時(shí)后，LC3II、Beclin1、ATG4D表達(dá)

8、均上調(diào)，細(xì)胞自噬增強(qiáng)，LPS濃度為500 ng/ml時(shí)，效果最明顯。
　　3. LPS刺激THP-1巨噬細(xì)胞后相關(guān)miRNAs變化情況：LPS刺激THP-1巨噬細(xì)胞12小時(shí)后，miR-101、miR-125a-5p較空白對(duì)照組表達(dá)均顯著下降。
　　4.過(guò)表達(dá)miR-101、miR-125a-5p對(duì)LC3II、Beclin1、ATG4D蛋白水平的影響：在細(xì)胞內(nèi)分別過(guò)表達(dá)miR-101、miR-125a-5p后，LC3II、AT