文心蘭乙烯代謝相關(guān)基因克隆與表達(dá)及ACO功能驗證.pdf

1、本研究以文心蘭雜種‘小櫻桃’文心蘭(Oncidium Kutoo'Little Cherry'，Onc. ornithorynchum×Tolu. variegata)試管苗為材料，進(jìn)行乙烯代謝相關(guān)基因克隆與表達(dá)及ACO功能驗證研究。采用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)，克隆到了ACC合成酶基因ACS3和ACS7的部分序列，乙烯受體基因ERS兩個成員ERS1、ERS2，銅離子轉(zhuǎn)運基因CTR/COPT6和COBRA的全長序列；克隆了COBRA

2、的gDNA序列；進(jìn)行了這些基因在文心蘭不同生長時期的qPCR分析；采用酶切連接法構(gòu)建ERS-GFP融合蛋白植物表達(dá)載體，通過洋蔥內(nèi)表皮單層細(xì)胞熒光顯色反應(yīng)，研究了ERS基因的亞細(xì)胞定位。此外，通過酶切連接法構(gòu)建ACO正義反義植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化煙草，進(jìn)行了文心蘭ACO的基因功能的初步驗證。主要研究結(jié)果如下：
　　1.文心蘭ACS3和ACS7基因的克隆及qPCR分析
　　本試驗克隆了文心蘭ACC合成酶基因ACS3和ACS7的部

3、分序列，其中ACS3已獲得的序列為1516bp，登錄號為：KF420438.1；ACS7已獲得的已知序列為1344bp，登錄號為：KJ650200。熒光定量PCR分析表明ACS3和ACS7的在文心蘭不同生長階段的表達(dá)情況并不相同，ACS3在文心蘭成苗期表達(dá)量最高，幼苗時期表達(dá)量最低，ACS7同樣在幼苗時期表達(dá)量最低，但是卻在原球莖時期表達(dá)量最高。
　　2.文心蘭 ERS的克隆、qPCR分析及亞細(xì)胞定位的研究
　　本試驗克隆了

4、乙烯受體基因 ERS兩個成員，ERS1全長序列為2327b，登錄號為：KJ155786；ERS2全長序列為2296bp，登錄號為：KJ155787，兩成員均含有一個1896bp的開放閱讀框，兩者的核苷酸相似性為97.5％，都編碼631個氨基酸，其中有18個氨基酸不同，都是疏水的不穩(wěn)定的中性蛋白，均不具有信號肽，亞細(xì)胞定位預(yù)測，最大可能在細(xì)胞膜中，并且通過洋蔥內(nèi)表皮侵染實驗驗證了這一預(yù)測。ER S的兩個成員都具有7個保守結(jié)構(gòu)域，3個跨膜螺

5、旋，18個磷酸位點。qPCR分析發(fā)現(xiàn)，ERS基因在原球莖時期表達(dá)量最高，在幼苗期表達(dá)量最低，類似ACS7。
　　3.文心蘭COPT6的克隆及 qPCR分析
　　克隆獲得的文心蘭銅離子轉(zhuǎn)運基因CTR/COPT6的全長序列788bp，登錄號為：KJ650199，含有一個長度為465bp的開放閱讀框，編碼154個氨基酸.生物信息學(xué)分析表明：COPT蛋白是疏水的穩(wěn)定性蛋白，不具有信號肽，最大可能定位于細(xì)胞膜，具有兩個跨膜結(jié)構(gòu)，只有兩

6、個磷酸位點，有兩個結(jié)構(gòu)域，沒有卷曲螺旋。三級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)COPT蛋白主要由α–螺旋構(gòu)成。熒光定量PCR分析表明COPT基因在幼苗期表達(dá)量最高，在成苗期表達(dá)量最低。
　　4.文心蘭COBRA基因的克隆及 qPCR分析
　　以文心蘭試管苗為材料，采用RT-PCR結(jié)合RACE法，分離了文心蘭COBRA基因cDNA全長和DNA序列，COBRA全長1601bp（GenBank檢索號為：KF739400.1），開放閱讀框（ORF）1386b

7、p，編碼461個氨基酸；COBRA的DNA序列共2949bp(GenBank檢索號為：KF861576)，有6個外顯子，5個內(nèi)含子。長度分別為115bp、80bp、457bp、160bp、281bp、293bp。qPCR結(jié)果表明, CORBA在成苗期表達(dá)量最高，在文心蘭原球莖時期表達(dá)量最低。
　　5.文心蘭ACO基因轉(zhuǎn)化煙草與功能的初步驗證
　　本試驗采用酶切連接法將ACO基因的正義和反義片段構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAM-BI

8、 A1301上，并將分別將正義/反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105的感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行煙草葉片的遺傳轉(zhuǎn)化，對轉(zhuǎn)基因植株的進(jìn)行PCR檢測，同時進(jìn)行GUS檢測，檢測目的基因的轉(zhuǎn)化結(jié)果。試驗結(jié)果表明：成功構(gòu)建了ACO基因的正義和反義植物表達(dá)載體，獲得正義轉(zhuǎn)化的煙草28株，反義轉(zhuǎn)化的煙草33株。通過PCR檢測及GUS染色檢測，大部分植株為轉(zhuǎn)基因陽性植株，正義轉(zhuǎn)化率為53.5%，反義轉(zhuǎn)化率為67.2%。同時進(jìn)行了乙烯利的處理，發(fā)現(xiàn)文心蘭ACO對