牛副流感病毒3型C和V蛋白通過負(fù)調(diào)控IRF7拮抗I型干擾素表達(dá)的研究.pdf

1、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type3，BPIV3)屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)，呼吸道病毒屬(Respirovims)的成員。BPIV3是單股負(fù)鏈的RNA病毒，能夠誘發(fā)牛呼吸道綜合征，引起牛產(chǎn)生副流行性感冒。多數(shù)牛感染BPIV3發(fā)病后，呈現(xiàn)食欲不振、發(fā)熱、結(jié)膜炎及咳嗽、氣喘、呼吸不暢等呼吸道感染癥狀，可引起母牛產(chǎn)奶量降低。牛群感染率高達(dá)90％，通常情況下在感染病毒的同時(shí)伴

2、有細(xì)菌的繼發(fā)感染使病情加劇，為我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
　　已有研究報(bào)道呼吸道病毒均能夠通過抑制干擾素的生成來抵抗宿主天然免疫。例如仙臺(tái)病毒、人副流感病毒的C蛋白和V蛋白均能夠通過調(diào)控干擾素信號(hào)通路中的多種信號(hào)分子抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。BPIV3的C蛋白和V蛋白能夠抑制解旋酶視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)和黑色素瘤分化相關(guān)蛋白5(MDA5)的表達(dá)從而抑制IFN-β的生成，而C、V蛋白能否作用抗病毒天然免疫應(yīng)答中的其他分子來

3、逃脫宿主免疫的研究還未見報(bào)道。
　　為進(jìn)一步探索BPIV3拮抗天然免疫的機(jī)制，本研究在胎牛腎細(xì)胞(MDBK)及牛肺細(xì)胞(BL)內(nèi)檢測(cè)BPIV3對(duì)干擾素信號(hào)通路相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄的作用中得出，BPIV3能夠明顯抑制干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF7)介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的表達(dá)。
　　過表達(dá)IRF7后能夠促進(jìn)IFN-α和IFN-β轉(zhuǎn)錄的激活，利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA敲低MDBK細(xì)胞內(nèi)的IRF7基因的表達(dá)（命名為L(zhǎng)V-IRF7shRNA-MDBK

4、），發(fā)現(xiàn)IFN-α和IFN-β以及干擾素下游通路的干擾素刺激因子15(ISG15)、干擾素刺激因子56(ISG56)和Mx1的表達(dá)量均降低，且與正常的MDBK細(xì)胞相比，LV-IRF7shRNA-MDBK細(xì)胞內(nèi)BPIV3的病毒滴度更強(qiáng)，證明了IRF7是機(jī)體抗病毒機(jī)制的關(guān)鍵因素。
　　本研究中克隆并表達(dá)BPIV3的C、V蛋白，制備C、V蛋白的多克隆抗體。將C、V基因載體分別轉(zhuǎn)染到MDBK細(xì)胞及BL細(xì)胞內(nèi)，利用qPCR及Western

5、blot檢測(cè)得出C、V蛋白均能夠抑制IRF7的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)。在抑制IRF7的同時(shí)，轉(zhuǎn)染C、V基因的細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型干擾素IFN-α和IFN-β及下游相關(guān)分子ISG56、Mx1的表達(dá)量也降低。C、V蛋白能夠抑制過表達(dá)IRF7誘導(dǎo)的IRF7及IFN-α、IFN-β的轉(zhuǎn)錄，說明了C、V蛋白可能通過調(diào)控IRF7抑制Ⅰ型干擾素通路。利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)C、V蛋白能夠有效地抑制BoIRF7、BoIFN-β啟動(dòng)子及NF-κB啟動(dòng)的熒光素酶的活性，