AP3B1基因在雌性生殖和子宮發(fā)育中作用的研究及CRISPR-CAS9技術在小鼠基因定點敲除中的應用.pdf

1、第一部分:AP3B1基因在雌性生殖和子宮發(fā)育中作用的研究
　　受社會快速發(fā)展給人們生活環(huán)境帶來的負面影響，不孕不育的發(fā)病率越來越高，據世界衛(wèi)生組織預測，不孕不育癥將成為21世紀的第三大疾病，僅次于腫瘤和心腦血管病。在眾多的不孕不育患者中女性子宮發(fā)育不良是主要病因之一，且尚無有效的治療方法。我們的研究發(fā)現(xiàn)pearl(pe)雌鼠存在典型的幼稚子宮現(xiàn)象，可以作為研究子宮發(fā)育不良的動物模型。pe小鼠是AP3B1基因突變引起的HPSⅡ動物模

2、型。HPS是一種常染色體隱性遺傳病，主要的臨床癥狀有肺部纖維化、出血、結腸炎等，目前在HPSⅡ病人和pe小鼠中尚無生殖能力下降的報道。
　　在本部分論文中，我們依次在整體、器官、以及細胞分子水平對pe小鼠的生殖系統(tǒng)進行了全面檢測，并對AP3B1基因導致pe雌鼠子宮發(fā)育不良的原因進行了深入探索。通過大規(guī)模交配實驗，我們發(fā)現(xiàn):與對照組相比，pe雌鼠的產仔數顯著降低，受孕幾率略微降低。進一步通過對各個年齡段pe雌鼠進行器官組織水平分析，

3、我們發(fā)現(xiàn):當發(fā)育到一個月時，pe雌鼠開始出現(xiàn)子宮發(fā)育不良的明顯特征，發(fā)育到三個月時pe雌鼠表現(xiàn)出顯著的幼稚子宮的特征;而在幼鼠時這一現(xiàn)象并不明顯。pe雌鼠的卵巢沒有明顯的發(fā)育異常，但其超排卵數量顯著降低，雌激素含量與B6相比沒有顯著差異。分子蛋白水平分析發(fā)現(xiàn):pe雌鼠的子宮發(fā)育的關鍵基因Hoxa10、Hoxa11、Wnt5a表達明顯降低;WesternBlot分析證實子宮發(fā)育過程重要的通路蛋白β-catenin在細胞質中表達量顯著高于B

4、6，在細胞膜上表達量顯著低于B6，我們認為受AP3B1基因突變影響，β-catenin的運輸過程發(fā)生障礙，導致其在細胞質中大量積累。
　　綜上所述，pe雌鼠表現(xiàn)出明顯的子宮發(fā)育不良的特征，是研究幼稚子宮的良好的動物模型，AP3B1基因突變引起子宮發(fā)育不良的原因很可能是AP3蛋白復合體的缺失影響了PCP-2和β-catenin的膜質定位，進而導致了子宮發(fā)育中重要的調控通路Wnt和Hox異常。對相關途徑的深入探究將加深我們對蛋白轉運的

5、認識，同時可以為臨床不孕不育研究提供新的思路。
　　第二部分:CRISPR-CAS9技術在小鼠基因定點敲除中的應用
　　對基因組中特定位點進行修飾的實驗手段稱為基因組編輯。它在研究基因的功能和基因修復以及細胞替代治療上有廣泛的應用前景。CRISPR-CAS9技術作為一門新興的基因修飾方法，憑借其眾多的優(yōu)勢正逐步成為傳統(tǒng)基因編輯方法強有力的替代者。2013年CRISPR-CAS9技術在小鼠基因定點敲除中得到了前所未有的普及和發(fā)

6、展，本部分論文的目的在于搭建小鼠受精卵顯微注射平臺，并在此基礎上初步探索CRISPR-CAS9技術在小鼠基因定點敲除中的應用。
　　小鼠受精卵顯微注射平臺主要由四部分組成，分別為受精卵的收集，受精卵的處理，受精卵的顯微注射和二細胞期胚胎移植。我們通過大量的重復實驗針對上述四個步驟摸索了一套合適的實驗條件，包括受精卵消化用的透明質酸酶濃度最佳為0.3mg/ml，受精卵收集的時間設在下午13:00最合適，胚胎移植的假孕雌鼠品系最好用C

7、D1。最終我們胚胎移植的多只CD1雌鼠成功生育，說明顯微注射平臺初步建設完成。
　　為了利用CRISPR-CAS9技術在我們建設的顯微注射平臺上進行小鼠基因敲除工作，我們選擇了附睪特異基因Teddm1和serpinalf,由于時間關系，我們完成了上述基因的靶點設計工作，后續(xù)的gRNA的構建和Cas9RNA的制備工作正在進行中。相信在未來CRISPR/Cas技術會在基因修飾領域得到全面的發(fā)展，并有效地推動基因功能的研究進程。