甘藍(lán)夜蛾細(xì)胞色素P450CYP4M及CYP6AB基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、細(xì)胞色素P450(cytochrome P450或CYP450，簡稱P450)是一種廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物體內(nèi)的氧化酶系，由數(shù)量眾多、功能復(fù)雜的一類血紅蛋白酶組成。在昆蟲中，P450分布在昆蟲的各個(gè)組織器官中，參與昆蟲生長、發(fā)育、繁殖等重要的生理活動(dòng)，例如昆蟲體內(nèi)蛻皮激素與保幼激素等內(nèi)源化合物的合成降解。它們對(duì)異生物質(zhì)的代謝作用導(dǎo)致了昆蟲對(duì)殺蟲劑的抗藥性和對(duì)植物毒素的耐受性。P450酶通過NADPH獲得電子起末端氧化的作用，由

2、P450催化的反應(yīng)不僅包括氧原子的轉(zhuǎn)移，同時(shí)P450酶還具有氧化酶、還原酶、異構(gòu)酶及脫氫酶的活性。分離昆蟲P450基因并研究其特征是明確P450如何參與蟲體內(nèi)重要的代謝過程的第一步，研究在很大程度上發(fā)現(xiàn)了昆蟲抗藥性形成的機(jī)理，以及使用殺蟲劑對(duì)昆蟲生物學(xué)和生理學(xué)的影響。
　　 本研究針對(duì)昆蟲P450基因在昆蟲體內(nèi)不同時(shí)期不同組織的存在著差異性，確定了在其活性較高的五齡幼蟲期提取mRNA，進(jìn)一步通過RT-PCR、RACE等技術(shù)克隆了

3、甘藍(lán)夜蛾P(guān)450CYP4M以及CYP6AB基因全長序列。
　　 CYP4M cDNA序列含有1909個(gè)堿基，包括一個(gè)1572個(gè)堿基的開放閱讀框，編碼一個(gè)含523個(gè)氨基酸的多肽，分子量約為60.9 kDa，等電點(diǎn)為8.65?；虻腸DNA序列已經(jīng)登錄GenBank并獲得登錄號(hào)JF731346。利用Expasy molecular biology server的Scanprosite facility對(duì)推導(dǎo)的甘藍(lán)夜蛾CYP4M氨基酸

4、的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，蛋白序列中含有P450酶的特征結(jié)構(gòu)FxxGxxxCxG(461-470)血紅蛋白結(jié)合域，與其它昆蟲CYP4M因有較高的同源性。將得到的CYP4M基因利用表達(dá)載體pET21b轉(zhuǎn)入受體BL21中進(jìn)行原核表達(dá)，經(jīng)異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，分別獲得與預(yù)測蛋白大小相同的蛋白條帶。
　　 CYP6AB cDNA序列含有1966個(gè)堿基，包括一個(gè)1539個(gè)堿基的開放閱讀框，編碼一個(gè)含512個(gè)氨基酸的多肽，分子量