熒光蛋白 (整理)

1、熒光熒光1、定義定義熒光（fluescence）又作“螢光”，是指一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長的入射光（通常是紫外線或X射線）照射，吸收光能后進入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的的波長長的出射光（通常波長在可見光波段）；而且一旦停止入射光，發(fā)光現(xiàn)象也隨之立即消失。具有這種性質(zhì)的出射光就被稱之為熒光。2、原理原理光照射到某些原子時，光的能量使原子核周圍的一些電子由原來的軌道躍遷到了能量更高的軌道，即從基態(tài)躍遷到

2、第一激發(fā)單線態(tài)或第二激發(fā)單線態(tài)等。第一激發(fā)單線態(tài)或第二激發(fā)單線態(tài)等是不穩(wěn)定的，所以會恢復(fù)基態(tài)，當(dāng)電子由第一激發(fā)單線態(tài)恢復(fù)到基態(tài)時，能量會以光的形式釋放，所以產(chǎn)生熒光。熒光是物質(zhì)吸收光照或者其他電磁輻射后發(fā)出的光。大多數(shù)情況下，發(fā)光波長比吸收波長較長，能量更低。但是，當(dāng)吸收強度較大時，可能發(fā)生雙光子吸收現(xiàn)象，導(dǎo)致輻射波長短于吸收波長的情況發(fā)射。當(dāng)輻射波長與吸收波長相等時，既是共振熒光。熒光強度：熒光強度與該種物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率、消光系數(shù)以

3、及含量等因素有關(guān)。熒光量子產(chǎn)率Q：量子產(chǎn)率表示物質(zhì)將吸收的光能轉(zhuǎn)化為熒光的本領(lǐng)，是熒光物質(zhì)發(fā)出光子數(shù)與吸收光子數(shù)的比值。熒光蛋白分子的亮度由其量子產(chǎn)率與消光系數(shù)的乘積決定，與成像檢測靈敏度密切相關(guān)。3、熒光蛋白熒光蛋白進該蛋白在細胞內(nèi)的降解。雖然，目前這些不穩(wěn)定變體還沒有在小鼠中應(yīng)用，但這些變體有利于實時追蹤基因表達動力學(xué)的研究。（6）增強型黃色熒光蛋白（）增強型黃色熒光蛋白（EYFPEYFP）另一種紅移變體是增強型黃色熒光蛋白（EYF

4、P），該變體有四個氨基酸突變。在527nm時，EYFP的發(fā)射光從綠色變?yōu)辄S綠色。EYFP熒光的亮度水平與EGFP相當(dāng)。EYFP抗酸性差、對鹵化物敏感，使它的應(yīng)用受到限制。在EYFP基礎(chǔ)上改進的突變體mCitrine[21]和mVenus[22]是目前應(yīng)用最多的黃色熒光蛋白。（7）增強型藍色熒光蛋白（）增強型藍色熒光蛋白（EBFPEBFP）在光譜的另一端是藍色藍綠色變體，包括增強型藍色熒光蛋白（EBFP）變體。它有四個氨基酸突變，激發(fā)波長

5、和發(fā)射波長分別為380nm和440nm。由于這些突變改進了蛋白折疊和發(fā)色團形成的效率，所以也增強了所發(fā)出熒光的亮度（與藍色變體相比）和蛋白溶解性。但唯一的不足之處，就是EBFP產(chǎn)生的熒光信號大致與wtGFP相當(dāng)。藍色熒光蛋白發(fā)光較弱，抗光漂白和抗酸性較差，用于細胞成像時背景信號高。針對EBFP開發(fā)的3個更亮的突變體：Azurite(亮度是EBFP的1.6倍)、EBFP2(亮度是EBFP的2倍，mTagBFP(亮度是EBFP的3.7倍)。

6、最亮的藍色熒光蛋白。mTagBFP是由紅色熒光蛋白TagRFP突變而來。（8）增強型藍綠色（青色）熒光蛋白）增強型藍綠色（青色）熒光蛋白（ECFPECFP）增強型藍綠色熒光蛋白（ECFP）是發(fā)出藍色藍綠色熒光的另一種變體，產(chǎn)生的熒光信號要比wtGFP強。ECFP有六個氨基酸突變（表3），發(fā)射光譜從綠色遷移到藍綠色，最大激波長在433nm（主峰）和453nm（次峰），最大發(fā)射在475nm，于510nm處有一肩峰（圖11）。ECFP另一特點

7、是比其它藍色藍綠色變體光漂白效應(yīng)弱，而且比EBFP的亮度強。值得一提的是，wtGFP的主要綠色熒光變體，如EGFP等已經(jīng)在ES細胞、基因打靶和轉(zhuǎn)基因小鼠研究中得到充分應(yīng)用。2、藍色及藍綠色熒光蛋白藍色及藍綠色熒光蛋白雖然EBFP是AequeaGFP來源的最早的光譜變體之一，但其亮度低、光穩(wěn)定性差，使其很久以來沒有引起多數(shù)研究者的注意。最近，有三個研究小組報道指出，改進的藍色Aequea熒光蛋白變體與EBFP相比，亮度和光敏感性有明顯增強

8、。這些新的變體被命名為Azurite（石青或藍銅礦）、強力增強型藍色熒光蛋白2（stronglyenhancedbluefluescentprotein2SBFP2）及EBFP2，它們第一次使得活細胞在藍色光譜區(qū)域成功地長時間成像成為可能。即使這三種熒光蛋白在高濃度的微環(huán)境中表現(xiàn)出很弱的二聚體特性，但是它們能夠在與亞細胞定位的靶蛋白融合中有效地發(fā)揮作用，并且它們能夠很容易地通過濾光片設(shè)備與標準的BFP及46二脒基2苯基吲哚（46diai