腫瘤微環(huán)境促進(jìn)骨髓播散腫瘤細(xì)胞(DTCs)形成的機(jī)制研究.pdf

1、目的:揭示腫瘤微環(huán)境啟動前列腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT并形成DTCs的分子機(jī)制，對該過程進(jìn)行阻斷，以減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
　　方法:運(yùn)用慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)luciferase的前列腺癌細(xì)胞系(PC3-luc，C4-2B-luc，RM-1-luc)，并以皮下接種的方式建立小鼠前列腺癌模型，待腫瘤長到一定大小時，將皮下腫瘤取出再培養(yǎng)并運(yùn)用Westernblot檢測EMT標(biāo)記蛋白的變化;運(yùn)用RT-PCR檢測皮下接種前列腺癌小鼠的DTC細(xì)

2、胞;對親本前列腺癌細(xì)胞及小鼠皮下前列腺癌細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特點(diǎn)的比較，并探索其分子機(jī)制;此外本研究還建立了前列腺癌細(xì)胞心內(nèi)注射和脛骨注射轉(zhuǎn)移模型，并分離培養(yǎng)了特異性肺轉(zhuǎn)移前列腺癌細(xì)胞。
　　結(jié)果:本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)luciferase的前列腺癌細(xì)胞系，建立了小鼠皮下前列腺癌接種模型，檢測到了小鼠骨髓中存在DTC細(xì)胞，且皮下腫瘤再培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)生了EMT改變，并獲得了更強(qiáng)的增殖、遷移侵襲及血管再生能力。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)其可能是由于A

3、kt調(diào)控MCP-1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，或經(jīng)Akt/AMPKα/mTOR信號通路調(diào)控所致。此外本研究建立的心內(nèi)注射小鼠模型和脛骨注射小鼠模型均發(fā)生了全身多臟器的轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論:接種于小鼠皮下的前列腺癌細(xì)胞在體內(nèi)微環(huán)境的作用下，發(fā)生了EMT轉(zhuǎn)化并促進(jìn)了DTCs的產(chǎn)生，且其獲得了更強(qiáng)的增殖、遷移侵襲和血管形成能力。這可能是由于Akt調(diào)控MCP-1高表達(dá)或Akt/AMPKα/mTOR信號通路調(diào)控所致。心內(nèi)注射及脛骨注射腫瘤模型可用于器官特異性

4、轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究。
　　第一部分 建立穩(wěn)定表達(dá)luciferase的前列腺癌細(xì)胞系
　　目的:構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)luciferase的前列腺癌細(xì)胞系。
　　方法:對pCDNA3.1、pGL3-control、pGL4.50及包裝質(zhì)粒VSV-G、pRRE、RSV-REV進(jìn)行質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及擴(kuò)增提取;對pCDNA3.1，pGL3-control脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染，pGL4.50脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，pGL4.50電穿孔轉(zhuǎn)染法，pGLV4-EF1a

5、-Luc慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)luciferase前列腺癌細(xì)胞株進(jìn)行比較。根據(jù)GFP的表達(dá)量，運(yùn)用流式細(xì)胞分選術(shù)收集高表達(dá)GFP的pGLV4-EF1a-Luc慢病毒轉(zhuǎn)染的PC3-luc和C4-2B-luc細(xì)胞;構(gòu)建luciferase慢病毒載體，運(yùn)用菌液PCR，質(zhì)粒電泳純化雙酶切及質(zhì)粒測序等方法鑒定連接正確的慢病毒載體，運(yùn)用VSV-G、pRRE、RSV-REV三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)在293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝并轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞株，Blastici

6、din抗生素進(jìn)行陽性篩選構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)luciferase的前列腺癌細(xì)胞株以及其他種類的細(xì)胞株。
　　結(jié)果:在對多種轉(zhuǎn)染方法比較之后，本研究最終選用購自上海吉瑪公司的pGLV4-EF1a-Luc慢病毒液構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)luciferase的PC3和C4-2B兩株前列腺癌細(xì)胞系PC3-luc和C4-2B-luc，并運(yùn)用流式細(xì)胞儀分選出了GFP強(qiáng)陽性的細(xì)胞。另外本研究自行構(gòu)建了luciferase慢病毒載體，挑選出菌液PCR、雙酶切、測序

7、等方法驗(yàn)證正確的載體進(jìn)行擴(kuò)增和包裝，構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)luciferase的小鼠RM-1前列腺癌細(xì)胞株RM-1－luc以及其他種類的前列腺癌細(xì)胞株，肝癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌及部分耐藥株等在內(nèi)的熒光素酶標(biāo)記細(xì)胞，以供實(shí)驗(yàn)室其他研究所用。
　　結(jié)論:與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法及電穿孔轉(zhuǎn)染法相比，慢病毒轉(zhuǎn)染法更適于構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞株。
　　第二部分 建立前列腺癌細(xì)胞體內(nèi)發(fā)生EMT的研究模型
　　目的:建立PC3-luc， C4-

8、2B-luc，RM-1-luc小鼠皮下接種腫瘤模型，發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的早期事件。
　　方法:將PC3-luc細(xì)胞接種于裸鼠皮下，C4-2B-luc細(xì)胞接種于SCID小鼠皮下和RM-1-luc細(xì)胞接種于C57BL/6J小鼠皮下（2×106 cells/只）;接種后每周一次活體成像，每周2次游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積并監(jiān)測小鼠體重變化，實(shí)時動態(tài)觀察腫瘤生長;待腫瘤長到一定大小時，將小鼠處死，取皮下腫瘤進(jìn)行體外再培養(yǎng)(PC3-luc s1，C4-

9、2B-luc s1，RM-1-luc s1)，觀察皮下腫瘤細(xì)胞的形態(tài)改變并運(yùn)用WB檢測與親本細(xì)胞相比，皮下腫瘤再培養(yǎng)細(xì)胞EMT標(biāo)志蛋白的改變。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了PC3-luc，C4-2B-luc，RM-1-luc皮下接種腫瘤模型并獲得了皮下腫瘤生長曲線;皮下腫瘤再培養(yǎng)細(xì)胞與親本細(xì)胞相比，形態(tài)發(fā)生了改變。EMT標(biāo)記檢測發(fā)現(xiàn)在與親本細(xì)胞相比，Vimentin和snail在PC3-luc s1細(xì)胞中的表達(dá)增高，而E-cadherin

10、，claudin-1和ZO-1在PC3-lucs1細(xì)胞中的表達(dá)下降。
　　結(jié)論:皮下腫瘤細(xì)胞發(fā)生了EMT改變。
　　第三部分 骨髓播散腫瘤細(xì)胞的檢測
　　目的:檢測皮下接種腫瘤細(xì)胞小鼠模型骨髓中是否存在DTC細(xì)胞
　　方法:接種了腫瘤細(xì)胞的小鼠待皮下腫瘤長到一定大小時，將小鼠處死，分離髂骨、股骨和脛骨（髂骨和股骨用于分離骨髓，脛骨用于固定脫鈣包埋），髂骨和股骨沖出骨髓后分別提取總RNA用于PCR檢測。PC3-Tx

11、R，DU145，CNE2小鼠骨髓來自于本實(shí)驗(yàn)室其他課題組的皮下腫瘤細(xì)胞接種模型。總RNA逆轉(zhuǎn)錄后檢測Luc2和Human GAPDH基因在小鼠骨髓mRNA水平的表達(dá)情況，小鼠GAPDH作為內(nèi)參;脛骨置于10％中性福爾馬林中固定24小時后，轉(zhuǎn)入10％EDTA脫鈣完全后轉(zhuǎn)移至70％乙醇保存并進(jìn)行石蠟包埋和切片。
　　結(jié)果:PCR結(jié)果顯示在這些腫瘤細(xì)胞接種的小鼠骨髓中有Luc2和HumanGAPDH的表達(dá)，而他們在正常對照小鼠的骨髓中沒

12、有表達(dá)。
　　結(jié)論:皮下接種了腫瘤細(xì)胞的小鼠骨髓中出現(xiàn)了DTCs。
　　第四部分 腫瘤微環(huán)境促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的改變
　　目的:檢測EMT發(fā)生后，獲得了間充質(zhì)表型的PC3-luc s1細(xì)胞的生物學(xué)特性改變。
　　方法:將PC3，PC3-luc和PC3-luc s1細(xì)胞分別再次注射于裸鼠皮下2×106cells/只），每周進(jìn)行一次活體成像，每周兩次游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小及體重監(jiān)測，比較兩株細(xì)胞在腫瘤生長過程中

13、所發(fā)生的變化。待腫瘤生長到一定大小時，將小鼠處死，分離皮下腫瘤，比較組織改變;用MTS法體外比較PC3， PC3-luc和PC3-luc s1的細(xì)胞增殖情況;運(yùn)用細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)及Transwell小室比較PC3，PC3-luc和PC3-luc s1三株細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　結(jié)果:在體內(nèi)，PC3-luc s1小鼠皮下腫瘤比PC3和PC3-luc小鼠皮下腫瘤生長速度快，均勻且表面布有更豐富的血管;體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)與PC3及PC3-

14、luc細(xì)胞相比，PC3-luc s1細(xì)胞增殖速度并未增加，遷移和侵襲能力均有增強(qiáng)。
　　結(jié)論:與PC3和PC3-luc相比，發(fā)生了EMT改變后的PC3-luc s1具有了更強(qiáng)的增殖，遷移侵襲和血管生成能力。
　　第五部分 微環(huán)境誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT并形成DTCs的作用機(jī)制
　　目的:揭示前列腺癌細(xì)胞在體內(nèi)生長過程中發(fā)生EMT并產(chǎn)生DTCs的分子機(jī)制。
　　方法:運(yùn)用antibody array，Protei

15、n/DNA array檢測PC3，PC3-luc，PC3-lucs1，C4-2B，C4-2B-luc，C4-2B-luc s1細(xì)胞的差異條件培養(yǎng)上清蛋白表達(dá)和核蛋白差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子;運(yùn)用STRING10.0軟件分析其可能的相關(guān)通路;通過ELISA和熒光定量RT-PCR驗(yàn)證其差異表達(dá)蛋白在PC3，PC3-luc，PC3-luc s1中的表達(dá)，Westem blot驗(yàn)證核差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子，并檢測相關(guān)重要通路蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:

16、與親本細(xì)胞相比，MCP-1在PC3-luc s1和C4-2B-luc s1條件培養(yǎng)上清中的表達(dá)均有增高;在PC3-luc s1細(xì)胞核中，轉(zhuǎn)錄因子c-Myb，SP-1表達(dá)下調(diào)，c-Jun表達(dá)上調(diào)，而CREB變化不大。總蛋白Western blot檢測結(jié)果顯示:p-Akt，Akt，p-AMPKα，AMPKα，p-mTOR，mTOR，p-p70S6K，p70S6K， p-4E-BP1，4E-BP1蛋白在PC3，PC3-luc，PC3-luc