microRNA表達(dá)譜在感染性疾病中的應(yīng)用研究.pdf

1、感染性疾病是指病毒、細(xì)菌、真菌等病原微生物感染人體后所致的疾病，通過(guò)接觸患者或其分泌物能在人群中互相傳播的就是傳染性疾病。近年來(lái)一些重大的傳染性疾病如2003年的SARS疫情、高致病性禽流感，2009年的甲型H1N1流行仍嚴(yán)重地威脅人民群眾的身體健康和生命安全，影響我國(guó)的社會(huì)穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷傳染性疾病是減少傳播機(jī)會(huì)、控制疫情的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其中實(shí)驗(yàn)室對(duì)致病菌的早期診斷起著決定性的作用，然而目前對(duì)一些重大的感染性疾病仍然缺乏

2、快速有效地診斷方法。microRNA(miRNA)是一類高度保守的、長(zhǎng)約22個(gè)核苷的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA。miRNA廣泛存在于真核生物中，調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)，在生長(zhǎng)、發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)、病毒感染、癌癥、心血管疾病等很多生命過(guò)程都起著重要的調(diào)控作用。近期研究發(fā)現(xiàn)miRNA在感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展上扮演了重要角色。本論文針對(duì)幾種有重大影響的感染性疾病，從miRNA表達(dá)譜角度研究病原微生物對(duì)宿主細(xì)胞的感染作用，探索宿主miRNA在感染的

3、發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中的作用機(jī)制，并開展血清miRNA作為重大感染性疾病快速診斷的應(yīng)用研究，取得了如下創(chuàng)新性成果:
　　 (1)系統(tǒng)研究了病毒感染宿主細(xì)胞后的miRNA表達(dá)譜變化，并由此分析了病毒與宿主的致病機(jī)制，為感染性疾病的診斷和治療提供新思路。建立了腺病毒3型(AD3)感染人喉癌上皮(Hep2)細(xì)胞的感染模型，通過(guò)高通量測(cè)序(SOLiD)方法檢測(cè)感染細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜，篩選出44種顯著高表達(dá)和36種顯著低表達(dá)的miRNA，

4、進(jìn)一步通過(guò)熒光定量PCR確認(rèn)了其中14種顯著變化的miRNA;通過(guò)病毒感染細(xì)胞后miRNA的時(shí)序性變化揭示了病毒在感染細(xì)胞的早期和晚期具有不同的感染機(jī)制。
　　 (2)miRNA在病毒和宿主的相互關(guān)系中起著重要作用，在腸道病毒71型(EV71)病毒感染Hep2細(xì)胞的感染模型中，我們通過(guò)高通量(SOLiD)測(cè)序檢測(cè)了EV71病毒感染后的細(xì)胞miRNA表達(dá)譜。研究發(fā)現(xiàn)64種miRNA顯著升高（2倍以上），基因本體論(GO)分析顯示這

5、些miRNA所調(diào)控的靶基因多與神經(jīng)、免疫、細(xì)胞死亡等通道有密切關(guān)系，而這些都與EV71的致病機(jī)制有關(guān)，因此miRNA在病毒和宿主的相互關(guān)系中起著非常重要的作用，可以為EV71病毒引起感染疾病的診斷和治療提供新方法。
　　 (3)血清miRNA表達(dá)譜用于病毒感染性疾病的診斷與分型。通過(guò)TaqManLow-DensityArray(TLDA)低密度芯片技術(shù)檢測(cè)了手足口病人的血清miRNA表達(dá)譜，篩選出102種顯著上調(diào)和26種顯著下調(diào)

6、的miRNA，并對(duì)70份病人血清進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。研究結(jié)果顯示6種血清miRNA(miR-148a,miR-143，miR-324-3p，miR-628-3p，miR-140-5p，miR-362-3p)具有較高的診斷價(jià)值，Receiver operating characteristic curve(ROC)操作者接受曲線的AreaUnderCurve(AUC)值在0.828至0.934之間;多元回歸分析表明這6種miRNA相結(jié)

7、合診斷的特異性達(dá)到92.7％，敏感性達(dá)到97.1％;研究還發(fā)現(xiàn)5種miRNA(miR-148a,miR-143，miR-324-3p，miR-545，miR-140-5p)在EV71和科薩其16型(CVA16)兩種亞型的血清中有顯著差異，其中miR-545，miR-324-3p，miR-143能夠區(qū)分這兩種手足口的致病病毒亞型。
　　 (4)血清miRNA表達(dá)譜用于活動(dòng)型肺結(jié)核病的早期診斷。通過(guò)TLDA技術(shù)檢測(cè)了肺結(jié)核病人的血清

8、miRNA表達(dá)譜，獲得90種顯著上調(diào)和7種顯著下調(diào)的miRNA（變化倍數(shù)達(dá)到2倍以上），篩選出差異性及特異性大的10種miRNA;并對(duì)30份病人及65份正常對(duì)照的血清進(jìn)行驗(yàn)證。研究結(jié)果顯示7種miRNA(miR-361-5p，miR-889，miR-576-3p，miR-210，miR-26a，miR-432，andmiR-134)的表達(dá)有顯著差異，其中miR-361-5p，miR-889，andmiR-576-3p顯示了較高的診斷價(jià)值