HBV-P22蛋白影響HepG2細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 我國(guó)是乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus，HBV)感染的高流行區(qū)，一般人群的乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitisBvirussurfaceantigen，HBsAg)陽(yáng)性率為9.09％，隨著HBV疫苗納入計(jì)劃免疫，一些大城市HBV感染率已有所降低，但HBV感染仍然是影響人類健康的重大公共問(wèn)題之一。 HBV感染與肝細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，CanbayA等認(rèn)為在慢性HBV感染中，病毒為保持持續(xù)感染，宿主則

2、為清除病毒而進(jìn)行雙方的較量，就病毒而言，在其增殖階段，抑制肝細(xì)胞凋亡，可使其在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)感染，大量繁殖；就宿主而言，細(xì)胞凋亡是限制病毒復(fù)制的自然細(xì)胞反應(yīng)。凋亡細(xì)胞迅速被吞噬而無(wú)毒性物質(zhì)漏出時(shí)，不會(huì)發(fā)生炎癥反應(yīng)。但在病理?xiàng)l件下凋亡細(xì)胞數(shù)過(guò)多，超過(guò)吞噬細(xì)胞吞噬能力，凋亡細(xì)胞自發(fā)性裂解而內(nèi)容物釋放，將會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)及組織損傷。在實(shí)際研究中，HBV感染與肝細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系相當(dāng)復(fù)雜，多種因素參與了肝細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，其中包括HBV病毒蛋白，目前研

3、究較多的是HBx蛋白，對(duì)前C/C蛋白與肝細(xì)胞凋亡的關(guān)系研究較少。HBV全基因組前C/C區(qū)開放讀框編碼多種病毒蛋白，主要包括HBcAg(P21)、HBeAg(P17)、25kD(P25)蛋白、22kD(P22)蛋白等，其中HBV/P22蛋白是由P25蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上切割信號(hào)肽后生成，HBV/P22蛋白在細(xì)胞內(nèi)組織蛋白酶作用下水解C-端肽段，形成17kD的HBeAg(P17)分泌到細(xì)胞外，但部分HBV/P22蛋白滯留于胞漿內(nèi)。 長(zhǎng)期以

4、來(lái)，人們認(rèn)為HBV前C/C區(qū)蛋白對(duì)細(xì)胞沒(méi)有生物調(diào)控作用，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)C區(qū)基因編碼的核心抗原可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)。HBcAg能反式抑制IFN-β基因轉(zhuǎn)錄，從而抑制細(xì)胞內(nèi)IFN蛋白的表達(dá)；它能反式抑制MXA基因啟動(dòng)子活性，EMSA證明HBcAg與MXA基因啟動(dòng)子有直接相互作用。在我們的前期實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)構(gòu)建HBcAg表達(dá)載體并篩選HepG2細(xì)胞克隆株進(jìn)行研究，結(jié)果表明HBcAg表現(xiàn)為抑制FasAb及IFNa誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡

5、效應(yīng)。HBV/P22蛋白含有核心抗原的全部氨基酸序列，因此該蛋白也可能參與抑制細(xì)胞凋亡。 TNFa在體內(nèi)主要存在于肝臟中，約占全身30％，TNFa是重癥肝炎發(fā)病的核心細(xì)胞因子之一，但體外研究表明，TNFa誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡需要某些因素協(xié)同作用，即TNFa誘發(fā)細(xì)胞凋亡需要其他因素在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行阻遏。放線菌素D(Act-D)是一種RNA合成抑制劑，Act-D處理后肝癌細(xì)胞對(duì)TNFa的刺激變得敏感，從而導(dǎo)致凋亡。有報(bào)道HBV/P22蛋白的

6、AA23-73部分與Fas死亡結(jié)合蛋白(FADD)的死亡效應(yīng)區(qū)(DED)有23.5％的同源性，F(xiàn)ADD是TNFa誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要通路蛋白，因此HBV/P22蛋白可能通過(guò)影響Fas-FasL介導(dǎo)的凋亡途徑，從而抑制TNFa誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究通過(guò)體內(nèi)、體外試驗(yàn)較為深入的研究HBV/P22蛋白對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響。 研究目的： 1、在體外實(shí)驗(yàn)中研究HBV/P22蛋白影響Act-D、TNFa誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡。

7、 2、在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中研究HBV/P22蛋白影響Act-D、TNFa誘導(dǎo)的HepG2瘤體細(xì)胞凋亡。 研究方法： 1、鑒定HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22細(xì)胞株穩(wěn)定表達(dá)HBV/P22蛋白：HepG2-pCDNA3.1+、HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22細(xì)胞株分別以1×106/孔接種于六孔板，3天后收集上清，雅培試劑檢測(cè)HBeAg表達(dá)，HBeAg含量S/CO參考值<2.1為陰性。前述兩組細(xì)胞株分別取107

8、個(gè)細(xì)胞裂解，常規(guī)方法進(jìn)行HBV/P22蛋白的Westernblot檢測(cè)。 2、HBV/P22蛋白影響HepG2細(xì)胞凋亡的體外研究：采用流式細(xì)胞術(shù)及原位末端標(biāo)記技術(shù)(terminaldeoxynucleotidemediatednickendlabelingTUNEL)檢測(cè)HBV/P22蛋白影響Act-D、TNFa誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡。使用終濃度為333nMAct-D及100μg/LTNFa誘導(dǎo)HepG2-pCDNA3.1+H

9、BV/P22細(xì)胞凋亡，同時(shí)以HepG2-pCDNA3.1+細(xì)胞作為對(duì)照，刺激時(shí)間6h后，使用流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry，F(xiàn)CM)，利用AnnexinV-FITC雙染色，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；同樣方法培養(yǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后，丙酮固定，樣本通透性處理后，使用TUNEL技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，DAB顯色液顯色，倒置顯微鏡下觀察。陽(yáng)性細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核呈棕黃色染色為陽(yáng)性，細(xì)胞核無(wú)棕黃色染色為陰性，隨機(jī)取5個(gè)視野，高倍鏡下(400×)觀察記數(shù)陽(yáng)

10、性細(xì)胞百分率。 3、裸鼠動(dòng)物模型的建立：BALB/c-nu/nu裸鼠16只，隨機(jī)分為2組。收集培養(yǎng)的HepG2-pCDNA3.1+和HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22細(xì)胞，以5×107/0.1ml/site細(xì)胞懸液分別注射于裸鼠的頸背部皮下。瘤體積平均值為100mm3左右，利用.Act-D、TNFa誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡，連續(xù)用藥5天，每天一次。停藥后第2天，處死裸鼠，收集瘤體標(biāo)本，瘤體組織石蠟包埋，組織切片制作及HE染色觀察

11、瘤體形態(tài)。 4、免疫組化檢測(cè)腫瘤組織HBV/P22蛋白表達(dá)：石蠟切片抗原修復(fù)后，按免疫組化常規(guī)步驟，用HBeAg單克隆抗體檢測(cè)HBV/P22蛋白表達(dá)。DAB顯色液顯色，倒置顯微鏡下觀察。陽(yáng)性細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核呈棕黃色染色為陽(yáng)性，細(xì)胞核無(wú)棕黃色染色為陰性。 5、TUNEL測(cè)定腫瘤組織細(xì)胞凋亡率：石蠟包埋的組織切片，按常規(guī)方法進(jìn)行脫蠟、水合、樣本通透性處理后，按TUNEL試劑盒操作，DAB顯色液顯色，倒置顯微鏡下觀察。陽(yáng)性

12、細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核呈棕黃色染色為陽(yáng)性，細(xì)胞核無(wú)棕黃色染色為陰性，隨機(jī)取5個(gè)視野，高倍鏡下(400×)觀察記數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率。 結(jié)果： 1、鑒定HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22細(xì)胞株穩(wěn)定表達(dá)HBV/P22蛋白；雅培分析檢測(cè)示HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22細(xì)胞培養(yǎng)上清HBeAg表達(dá)陽(yáng)性，對(duì)照組為陰性：Westernblot檢測(cè)顯示HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22細(xì)胞有HBV/P22蛋白

13、表達(dá)，對(duì)照組為陰性。 2、HBV/P22蛋白影響HepG2細(xì)胞凋亡的體外研究：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率(3.77±0.76)％顯著低于對(duì)照組(23.31±5.82)％，(t=5.771，P=0.004)；細(xì)胞TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率(7.20±1.25)％顯著低于對(duì)照組(15.28±1.48)％，(t=9.349，P=0.000)。 3、裸鼠動(dòng)物模型的建立：在飼養(yǎng)及用藥過(guò)程中，HepG2-pC

14、DNA3.1+HBV/P22細(xì)胞組裸鼠死亡2只，HepG2-pCDNA3.1+細(xì)胞組裸鼠死亡3只，每組取5只進(jìn)行檢測(cè)，HE染色觀察瘤體形態(tài)良好。 4、免疫組化檢測(cè)腫瘤組織HBV/P22蛋白的表達(dá)：結(jié)果顯示注射HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22細(xì)胞株的動(dòng)物腫瘤組織有較好的HBV/P22蛋白表達(dá)，對(duì)照組為陰性。 5、人肝癌腫瘤組織細(xì)胞TUNEL測(cè)定：TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示接種HepG2-pCDNA3.1+HBV/P