間充質(zhì)干細(xì)胞株C3H10移植治療小鼠實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎的研究.pdf

1、目的及意義：
　　 實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性(自身免疫性)腦脊髓炎(Experimental autoimmuneencephalomyelitis，EAE)是一種由活化T細(xì)胞介導(dǎo)的器官特異性自身免疫性疾病，主要病理特征為血管周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)和中樞神經(jīng)脫髓鞘反應(yīng)，在臨床癥狀、生化指標(biāo)及病理等方面與多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis，MS)具有相似的特征，因此EAE被認(rèn)為是研究MS的良好動(dòng)物模型。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者多用易感動(dòng)物

2、建立EAE模型，用以闡明MS及EAE的發(fā)病機(jī)制，并為其檢測(cè)病情、預(yù)防復(fù)發(fā)、合理治療方案的選擇以及新方法、新藥物的篩選等提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為此建立穩(wěn)定可靠的EAE動(dòng)物模型是為今后開(kāi)展EAE系列研究的基礎(chǔ)。已有研究發(fā)現(xiàn)在EAE早期將脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)靜脈輸注動(dòng)物模型體內(nèi)，可以減輕脊髓炎癥和脫髓鞘改變，并在淋巴器官和中樞神經(jīng)系統(tǒng)能夠檢測(cè)到該成體干細(xì)胞(adult stemcells，ASCs)，但確切的作用及機(jī)制尚未探討。隨著對(duì)間充質(zhì)

3、干細(xì)胞(mesenchymalstem cells，MSCs)免疫學(xué)特性的深入研究，相信在不久的將來(lái)MSCs在自身免疫性疾病(autoimmune disease，AID)的領(lǐng)域中將會(huì)得到廣泛應(yīng)用。本研究旨在觀察鼠源性間充質(zhì)干細(xì)胞株C3H10移植對(duì)EAE小鼠模型疾病進(jìn)程的影響，為研究MS等AID的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 第一部分：24只C57BL/6J雌性10周齡小鼠隨機(jī)分成三組，即未干預(yù)對(duì)照組、C3H1

4、0細(xì)胞移植組(前兩組為實(shí)驗(yàn)組)和正常對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG35-55)加完全弗氏佐劑(complete freund adjuvant，CFA)制備抗原佐劑乳化物于腋下皮下單點(diǎn)單次注射免疫小鼠，分別在免疫當(dāng)天和24小時(shí)后尾靜脈注射百日咳毒素(bordetella pertussisvaccine，BPV)，對(duì)照組皮下和尾靜脈注射PBS，在免疫

5、第八天通過(guò)尾靜脈注射羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)染色后的C3H10細(xì)胞至細(xì)胞移植組小鼠體內(nèi)。觀察三組動(dòng)物發(fā)病的臨床表現(xiàn)，按照國(guó)際通用的五分制評(píng)分法連續(xù)進(jìn)行神經(jīng)功能分級(jí)評(píng)分并結(jié)合持續(xù)35天的體重測(cè)量，于免疫后第12-24天取癥狀明顯的未干預(yù)對(duì)照組小鼠和C3H10細(xì)胞移植組、正常對(duì)照組小鼠的脊髓進(jìn)行冰凍切片行HE染色、Luxol F

6、ast-blue髓鞘染色觀察小鼠腦和脊髓的病理學(xué)改變，從而鑒定EAE模型是否成功，C3H10細(xì)胞移植組小鼠是否在體征表現(xiàn)、脊髓的病理學(xué)改變等方面呈現(xiàn)明顯的治療作用。
　　 第二部分：采用新鮮脊髓組織冰凍切片的方法處理C3H10細(xì)胞移植組小鼠，在熒光顯微鏡下尋找C3H10細(xì)胞并觀察其是否成功進(jìn)入脊髓組織。
　　 結(jié)果：
　　 (1)動(dòng)物行為學(xué)的改變：免疫后第十天開(kāi)始，未干預(yù)對(duì)照組小鼠陸續(xù)出現(xiàn)EAE臨床癥狀，第14-

7、18天達(dá)到發(fā)病高峰，平均神經(jīng)功能評(píng)分為2±0.53(p<0.05)；C3H10細(xì)胞移植組小鼠有一只第14天和第18天評(píng)分為1分，正常對(duì)照組小鼠一直未出現(xiàn)臨床癥狀(0分)，持續(xù)觀察35天。(2)體重變化：未干預(yù)對(duì)照組小鼠體重呈逐漸下降趨勢(shì)，第14天體重約18.93±2.12g，第22天體重約18.65±2.04g；C3H10細(xì)胞移植組小鼠體重有上升趨勢(shì)，于免疫后第14天測(cè)體重為18.7±0.93g，免疫后第22天小鼠體重保持在19.26±

8、0.58g，兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。(3)病理學(xué)改變：未干預(yù)對(duì)照組小鼠腦和脊髓小血管周?chē)准?xì)胞浸潤(rùn)，呈袖套狀或脫髓鞘改變，而C3H10細(xì)胞移植組和正常對(duì)照組小鼠未出現(xiàn)明顯的腦和脊髓小血管炎癥的病理變化。(4)顯微鏡下觀察：在C3H10細(xì)胞移植組小鼠的脊髓組織中觀察到有C3H10細(xì)胞形態(tài)的熒光出現(xiàn)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)本實(shí)驗(yàn)建立的小鼠模型在體征表現(xiàn)、病理變化等方面符合復(fù)發(fā)-非緩解型EAE的表現(xiàn)，模型穩(wěn)