洛伐他汀合成調控基因LovE-mkH的克隆與表達.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究目的： 克隆紅曲霉和土曲霉洛伐他汀合成酶調控基因lovE和mkH并進行比對分析；原核表達并純化洛伐他汀合成轉錄因子lovE蛋白；構建lovE基因的真核表達載體。 研究方法： 根據genebank已知的土曲霉和紅曲霉洛伐他汀合成酶基因序列設計引物，以土曲霉和紅曲霉基因組DNA為模板PCR擴增lovE和mkH基因并克隆到pMD19T-simple載體。利用DNAMAN等軟件以及互聯(lián)網資源對lovE和mkH測序結果

2、與其編碼的氨基酸序列進行分析比對。根據genebank已知的土曲霉洛伐他汀合成酶基因序列另行設計引物，以土曲霉基因組DNA為模板PCR擴增lovE基因并定向克隆到pET-21b原核表達載體。IPTG誘導lovE-His融合蛋白表達，應用Ni-NTA His標簽蛋白純化樹脂親和層析純化融合蛋白。根據genebank已知的土曲霉洛伐他汀合成酶基因序列設計兩對引物，以土曲霉基因組DNA為模板PCR分別擴增lovE和lovElong基因并以兩對

3、插入位點定向克隆到pBC–hygro真核表達載體。 研究結果： 分別擴增得到1512bp和1464bp的目的片段lovE和mkH；成功構建原核重組表達載體pET–lovE，表達出約58KDa的融合蛋白lovE-His并純化至電泳純；成功構建真核重組表達載體pBC-lovE和pBC-lovElong。 研究結論： lovE和mkH同源性很高，并與genebank中相關已知序列基本相同，是洛伐他汀生物合成酶調

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