MLC-2v心肌特異性核心啟動子和RTP801核心缺氧反應性增強子調(diào)控下VEGF-,165-和FGF-,2-的高效共表達.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:驗證RTP801啟動子的核心缺氧反應性增強子對CMV啟動子下游VEGF,165>和FGF<,2>的表達的增強作用，并進一步驗證MLC-2v心肌特異性啟動子的核心片段和RTP801啟動子的核心缺氧反應性增強子調(diào)控下下游VEGF<,165>和FGF<,2>的心肌特異性和缺氧反應性高效表達。 方法:通過PCR方法從pSEC/Igк-VEGF<,165>/IRES/Igк-FGF<,2>重組質(zhì)粒中獲取Igк-VEGF<,165>/

2、IRES/Igк-FGF<,2>片段(Igк為分泌引導信號Igк-chain leader的DNA片段)，接入pIERS載體中的多克隆位點中，構(gòu)建了pIERS/Igк-VEGF<,165>/IRES/Igк-FGF<,2>重組質(zhì)粒。利用PCR的方法，從小鼠基因組DNA中獲取RTP801啟動子(Genebank NC000076)的核心部分增強子(core hypoxia-response enhancer，core HRE)的337～5

3、11bp(加上兩端酶切位點和保護堿基共202bp、)，替換pIERS/Igк-VEGF<,165>/IRES/Igк-FGF<,2>重組質(zhì)粒上的CMV增強子(150～390bp)，從而構(gòu)建了pIRES/RTP801 core HRE/Igк-VEGF<,165>/IRES/Igк-FGF<,2>重組質(zhì)粒。利用生物性可降解的聚乙烯亞胺(PEI)多分支樹狀聚合物將重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染293細胞，在正常和缺氧條件下分別培養(yǎng)36小時，Western

4、-blot檢測細胞內(nèi)VEGF<,165>和FGF<,2>的表達。ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中分泌性蛋白VEGF<,165>和FGF<,2>的表達。利用PCR的方法，從大鼠基因組中獲取心肌特異性的MLC-2v啟動子，即心肌球蛋白輕鏈啟動子(myosin lignt chain 2v promoter，Genebank U26708)的1714bp～1975bp的261bp的核心部分啟動子(core promoter)(加上兩端酶切位點和保護

5、堿基共289bp)，替換已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pIRES/RTP801 HRE/Igк-VEGF<,165>/IRES/Igк-FGF<,2>上的CMV啟動子，構(gòu)建pIRES/MLC-2v core promoter/RTP801 core HRE/Igк-VEGF<,165>/IRES/Igк-FGF<,2>重組質(zhì)粒，利用生物性可降解的聚乙烯亞胺(PEI)多分支樹狀聚合物將重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染大鼠心肌細胞系H<,9>C<,2>細胞和293細胞，

6、在正常在正常和缺氧條件下分別培養(yǎng)36小時，Western-blot檢測細胞內(nèi)VEGF<,165>和FGF<,2>的表達并用ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中分泌性蛋白VEGF<,165>和FGF<,2>的表達。利用生物性可降解的聚乙烯亞胺(PEI)多分支樹狀聚合物將重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染大鼠心肌細胞系H<,9>C<,2>細胞和293細胞，在正常在正常和缺氧條件下分別培養(yǎng)12小時，以RT-PCR檢測細胞內(nèi)VEGF<,165>和FGF<,2>在mRNA水

7、平的表達。 結(jié)果:真核表達載體 pIRES/RTP801 HRE/Igк-VEGF<,165>/IRES/Igк-FGF<,2>經(jīng)PCR和酶切分析及測序證實構(gòu)建成功，Western-blot和ELISA檢測證實重組質(zhì)粒中的VEGF<,165>和FGF<,2>在RTP801HRE介導下在缺氧293細胞有高效的共表達。真核表達載體pIRES/MLC-2v core promoter/RTP801 core HRE/Igк-VEGF<

8、,165>/IRES/Igк-FGF<,2>經(jīng)PCR和酶切分析及測序證實構(gòu)建成功，RT-PCR和ELISA檢測證實，重組質(zhì)粒中的VEGF<,165>和FGF<,2>在MLC-2v core promoter和RTP801HRE的介導下在缺氧的大鼠心肌細胞系H<,9>C<,2>細胞中有高效和特異的共表達。 結(jié)論:獲取的RTP801的核心缺氧反應性增強子在缺氧狀態(tài)下有顯著增強下游基因表達的功能，由此構(gòu)建的真核質(zhì)粒pIRES/RTP8

9、01 HRE/Igк-VEGF<,165>/IRES/Igк-FGF<,2>在缺氧下高效表達VEGF<,165>和FGF<,2>。心肌特異性的MLC-2v啟動子和RTP801的核心缺氧反應性增強子在共用時有增強下游基因心肌特異性和缺氧反應性高效表達的作用，由此構(gòu)建的真核質(zhì)粒pIRES/MLC-2v core promoter/RTP801 core HRE/Igк-VEGF<,165>/IRES/Igк-FGF<,2>在缺氧的大鼠心肌細

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