MLC-2v心肌特異性核心啟動(dòng)子和RTP801核心缺氧反應(yīng)性增強(qiáng)子調(diào)控下VEGF-,165-和FGF-,2-的高效共表達(dá).pdf

1、目的:驗(yàn)證RTP801啟動(dòng)子的核心缺氧反應(yīng)性增強(qiáng)子對(duì)CMV啟動(dòng)子下游VEGF,165>和FGF<,2>的表達(dá)的增強(qiáng)作用，并進(jìn)一步驗(yàn)證MLC-2v心肌特異性啟動(dòng)子的核心片段和RTP801啟動(dòng)子的核心缺氧反應(yīng)性增強(qiáng)子調(diào)控下下游VEGF<,165>和FGF<,2>的心肌特異性和缺氧反應(yīng)性高效表達(dá)。 方法:通過(guò)PCR方法從pSEC/Igк-VEGF<,165>/IRES/Igк-FGF<,2>重組質(zhì)粒中獲取Igк-VEGF<,165>/

2、IRES/Igк-FGF<,2>片段(Igк為分泌引導(dǎo)信號(hào)Igк-chain leader的DNA片段)，接入pIERS載體中的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建了pIERS/Igк-VEGF<,165>/IRES/Igк-FGF<,2>重組質(zhì)粒。利用PCR的方法，從小鼠基因組DNA中獲取RTP801啟動(dòng)子(Genebank NC000076)的核心部分增強(qiáng)子(core hypoxia-response enhancer，core HRE)的337～5

3、11bp(加上兩端酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基共202bp、)，替換pIERS/Igк-VEGF<,165>/IRES/Igк-FGF<,2>重組質(zhì)粒上的CMV增強(qiáng)子(150～390bp)，從而構(gòu)建了pIRES/RTP801 core HRE/Igк-VEGF<,165>/IRES/Igк-FGF<,2>重組質(zhì)粒。利用生物性可降解的聚乙烯亞胺(PEI)多分支樹狀聚合物將重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，在正常和缺氧條件下分別培養(yǎng)36小時(shí)，Western

4、-blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)VEGF<,165>和FGF<,2>的表達(dá)。ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中分泌性蛋白VEGF<,165>和FGF<,2>的表達(dá)。利用PCR的方法，從大鼠基因組中獲取心肌特異性的MLC-2v啟動(dòng)子，即心肌球蛋白輕鏈啟動(dòng)子(myosin lignt chain 2v promoter，Genebank U26708)的1714bp～1975bp的261bp的核心部分啟動(dòng)子(core promoter)(加上兩端酶切位點(diǎn)和保護(hù)

5、堿基共289bp)，替換已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pIRES/RTP801 HRE/Igк-VEGF<,165>/IRES/Igк-FGF<,2>上的CMV啟動(dòng)子，構(gòu)建pIRES/MLC-2v core promoter/RTP801 core HRE/Igк-VEGF<,165>/IRES/Igк-FGF<,2>重組質(zhì)粒，利用生物性可降解的聚乙烯亞胺(PEI)多分支樹狀聚合物將重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞系H<,9>C<,2>細(xì)胞和293細(xì)胞，

6、在正常在正常和缺氧條件下分別培養(yǎng)36小時(shí)，Western-blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)VEGF<,165>和FGF<,2>的表達(dá)并用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中分泌性蛋白VEGF<,165>和FGF<,2>的表達(dá)。利用生物性可降解的聚乙烯亞胺(PEI)多分支樹狀聚合物將重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞系H<,9>C<,2>細(xì)胞和293細(xì)胞，在正常在正常和缺氧條件下分別培養(yǎng)12小時(shí)，以RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)VEGF<,165>和FGF<,2>在mRNA水

7、平的表達(dá)。 結(jié)果:真核表達(dá)載體 pIRES/RTP801 HRE/Igк-VEGF<,165>/IRES/Igк-FGF<,2>經(jīng)PCR和酶切分析及測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功，Western-blot和ELISA檢測(cè)證實(shí)重組質(zhì)粒中的VEGF<,165>和FGF<,2>在RTP801HRE介導(dǎo)下在缺氧293細(xì)胞有高效的共表達(dá)。真核表達(dá)載體pIRES/MLC-2v core promoter/RTP801 core HRE/Igк-VEGF<

8、,165>/IRES/Igк-FGF<,2>經(jīng)PCR和酶切分析及測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功，RT-PCR和ELISA檢測(cè)證實(shí)，重組質(zhì)粒中的VEGF<,165>和FGF<,2>在MLC-2v core promoter和RTP801HRE的介導(dǎo)下在缺氧的大鼠心肌細(xì)胞系H<,9>C<,2>細(xì)胞中有高效和特異的共表達(dá)。 結(jié)論:獲取的RTP801的核心缺氧反應(yīng)性增強(qiáng)子在缺氧狀態(tài)下有顯著增強(qiáng)下游基因表達(dá)的功能，由此構(gòu)建的真核質(zhì)粒pIRES/RTP8

9、01 HRE/Igк-VEGF<,165>/IRES/Igк-FGF<,2>在缺氧下高效表達(dá)VEGF<,165>和FGF<,2>。心肌特異性的MLC-2v啟動(dòng)子和RTP801的核心缺氧反應(yīng)性增強(qiáng)子在共用時(shí)有增強(qiáng)下游基因心肌特異性和缺氧反應(yīng)性高效表達(dá)的作用，由此構(gòu)建的真核質(zhì)粒pIRES/MLC-2v core promoter/RTP801 core HRE/Igк-VEGF<,165>/IRES/Igк-FGF<,2>在缺氧的大鼠心肌細(xì)