Erbin對Her2陽性乳腺腺癌細胞的遷移能力及赫賽汀耐藥的影響及相關機制研究.pdf

1、目的:
　　 乳腺癌是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，全球每年約120萬人被確診為乳腺癌，每年約有70萬人死于此類疾病，在所有癌癥引發(fā)的死亡中排名第三，僅次于肺癌和胃癌。乳腺癌的發(fā)病機制十分復雜，表皮生長因子受體2(Her2)在20-30％的乳腺癌中過表達，而且與患者的不良預后密切相關。因此探索Her2相互作用分子的生物學功能、闡明相關的分子機制對于深入了解Her2陽性乳腺癌的病理生理學過程及改善患者的預后具有重要意義。

2、　　 Erbin是應用酵母雙雜技術研究Her2相互作用蛋白時被發(fā)現(xiàn)的，因其可與Her2發(fā)生直接的，特異的相互作用，故命名為Her2/ErbB2相互作用蛋白(ErBb2interactionprotein)，簡稱Erbin。Erbin廣泛表達于正常的上皮組織中。已有研究證實，Erbin可以負向調控Her2下游RAS-RAF-ERK信號通路的活化。但在Her2陽性乳腺癌中Erbin的表達水平及表達模式尚不清楚，Erbin在Her2陽性乳腺

3、癌中的生物學功能及對其惡性演進過程的影響亦未見報道。本次研究中，發(fā)現(xiàn)在Her2陽性乳腺癌組織中，Erbin的表達顯著降低，甚至出現(xiàn)了表達丟失的現(xiàn)象。實驗結果表明，在Her2陽性的乳腺癌細胞中敲低Erbin表達可明顯增強細胞的遷移能力，誘導乳腺癌細胞出現(xiàn)侵襲表型。同時還發(fā)現(xiàn)，敲低Erbin表達可誘導Her2陽性的乳腺癌細胞對治療性單抗赫賽汀產生抗性。分子機制的研究表明，敲低Erbin主要通過誘導AKT信號通路的異?；罨瘉韺崿F(xiàn)上述的生物學效

4、應。這些結果提示，Erbin通過調控AKT信號通路影響乳腺癌細胞的遷移能力及對赫賽汀的耐藥，從而可能在Her2陽性乳腺癌的惡性演進過程中發(fā)揮著重要作用。
　　 方法:
　　 應用Erbin特異性抗體、通過免疫組織化學染色在人乳腺癌組織芯片中檢測Erbin在蛋白水平的表達情況;通過Oncomine數據庫檢索，探索在Her2陽性的乳腺癌組織中Erbin在mRNA水平的表達情況;通過免疫印跡法及實時定量PCR檢測在乳腺癌細胞系

5、中，Erbin在轉錄水平及蛋白水平的表達情況;設計并構建了ErbinshRNA表達載體，通過細胞轉染、病毒感染以及蛋白質免疫印跡，檢測在Her2陽性乳腺癌細胞中敲低Erbin表達對Heregulin誘導的AKT信號通路活化的影響;通過構建Erbin真核表達載體、細胞轉染及免疫印跡法檢測了，在Her2陽性的乳腺癌細胞中過表達Erbin對Heregulin誘導的AKT活化的影響;通過CCK8（細胞增殖檢測），探索敲低Erbin表達對Her2

6、陽性乳腺癌細胞增殖的影響;通過流式細胞術，檢測敲低Erbin表達對Her2陽性乳腺癌細胞的細胞周期行進的影響;通過二維培養(yǎng)條件下的細胞劃痕實驗，檢測了敲低Erbin表達對Her2陽性乳腺癌細胞遷移能力的影響;通過Matrigel細胞三維培養(yǎng)法，檢測敲低Erbin表達對Her2陽性乳腺癌細胞侵襲表型形成的影響;應用AKT及ERK信號通路的特異性抑制劑，探索敲低Erbin影響細胞遷移及侵襲表型形成的分子機制;通過細胞增殖檢測實驗，檢測敲低E

7、rbin表達對靶向Her2的治療性抗體-赫賽汀細胞增殖抑制效應的影響;通過細胞海綿三維細胞培養(yǎng)法，檢測敲低Erbin對Her2陽性乳腺癌細胞赫賽汀耐藥的影響;通過細胞錨定非依賴增殖檢測法，探索敲低Erbin表達對Her2陽性乳腺癌細胞的赫賽汀敏感性的影響;應用AKT及ERK特異性抑制劑，探索Erbin影響Her2陽性乳腺癌細胞赫賽汀耐藥的分子機制。
　　 結果:
　　 1、Erbin在乳腺癌及Her2陽性乳腺癌組織中表達

8、顯著降低
　　 免疫組化的結果表明，在所檢測的10例正常乳腺組織中，8例呈現(xiàn)Erbin高表達（++-+++）;而在20例浸潤性乳腺癌組織中，Erbin的表達水平普遍偏低，甚至出現(xiàn)了表達丟失的現(xiàn)象。15例乳腺癌組織Erbin的表達水平為“+”或陰性，僅5例為“++”。在Oncomine數據庫檢索時發(fā)現(xiàn)了一組含有53例浸潤性乳腺癌的樣本。通過與正常乳腺組織進行比較，發(fā)現(xiàn)這是一組高Her2陽性率的乳腺癌樣本，在53例樣本中有52例為H

9、er2陽性，僅有1例為Her2陰性。同時檢索了該組樣本中Erbin在mRNA水平的表達情況。結果表明，在52例樣本中ErbinmRNA的水平都顯著低于正常乳腺組織，僅有一例例外。這一發(fā)現(xiàn)與之前在乳腺癌組織芯片中檢測得到的結果相符，提示Erbin表達水平在Her2陽性乳腺癌組織中顯著下降。通過對該組患者的預后進行分析發(fā)現(xiàn)，與那些三年內未出現(xiàn)腫瘤復發(fā)的患者相比，三年內出現(xiàn)復發(fā)的患者標本中Erbin表達水平的下調更為顯著。提示Erbin在He

10、r2陽性乳腺癌的惡性演進過程中可能發(fā)揮著重要作用。此外本次實驗還應用Western-blot及實時定量RT-PCR法檢測了人乳腺上皮細胞MCF-10A及5種乳腺癌細胞系(MCF-7、MCF-7/Her2、MDA-453、T47D、MDA-435)中檢測了Erbin在轉錄水平和蛋白水平的表達情況。實驗結果表明，在轉錄水平，MCF-7、MCF-7/Her2及T47D細胞的Erbin表達明顯低于MCF-10A細胞。而MDA-453細胞Erbi

11、n表達顯著高于MCF-10A細胞。在蛋白水平，與MCF-10A細胞相比，MCF-7、MCF-7/Her2、MDA-453、MDA-435細胞Erbin的表達水平相對較低。
　　 2、Erbin可在Her2陽性乳腺癌細胞中負調控AKT信號通路的活化
　　 設計并構建了ErbinshRNA的慢病毒表達載體，利用慢病毒感染的方法獲得了三株穩(wěn)定敲低Erbin的乳腺癌細胞（均為Her2陽性乳腺癌細胞），分別命名為MDA-453-E

12、rbin-sh、SKBR3-Erbin-sh和MCF-7/Her2-Erbin-sh。Western-blot檢測結果表明，在這三種感染ErbinshRNA慢病毒的細胞中，Erbin的表達被顯著抑制。同時，將感染表達對照shRNA慢病毒的細胞作為對照組。通過應用Her2的激活分子Heregulin分別刺激上述乳腺癌細胞，檢測Her2下游的主要促生存信號通路的變化。實驗結果表明，在MCF-7/Her2對照細胞中，Heregulin的刺激可

13、以使AKT的磷酸化發(fā)生一個先升后降，如同“拋物線”樣的變化;但在MCF-7/Her2-Erbin-sh細胞中，Heregulin刺激所造成的AKT的磷酸化，無論強度還是持續(xù)的時間都明顯強于對照細胞。在MDA-453細胞中，Heregulin的刺激可以使對照細胞的AKT出現(xiàn)一個先快速磷酸化繼而緩慢下降的過程，雖然沉默Erbin的表達并沒有顯著提高p-AKT的水平，但是造成了AKT的持續(xù)活化，即使在刺激六小時后，其活化程度依然沒有明顯的衰減

14、。在SKBR3-Erbin-sh細胞中也得到了同樣的結果，即在高表達Her2的乳腺癌細胞中，Erbin表達下調可增強由Heregulin誘導的AKT的磷酸化。上述實驗表明，在高表達Her2的乳腺癌細胞中，Erbin表達的缺失可增強由Heregulin誘導及Her2激活所導致的AKT的磷酸化。為進一步探討Erbin對AKT信號通路的調控作用，實驗中構建了Erbin的真核表達載體，并將其瞬時轉染Her2陽性乳腺癌細胞MCF-7/Her2和M

15、DA-453，轉染48小時后用無血清的培養(yǎng)基饑餓細胞過夜，然后用Heregulin刺激細胞。WesternBlot的結果顯示，Erbin過表達可顯著抑制Heregulin誘導的AKT活化。這進一步證明了，在高表達Her2的乳腺癌細胞中，Erbin對于Heregulin誘導的AKT信號通路活化具有負向調控作用。
　　 3、Erbin缺失可促進AKT信號依賴的細胞遷移及侵襲
　　 為進一步探索Erbin表達降低在Her2陽性

16、乳腺癌惡性演進過程中的意義。首先通過體外劃痕實驗進行檢測敲低Erbin表達對Her2陽性乳腺癌細胞遷移能力的影響。結果表明，在MCF-7/Her2細胞中敲低Erbin的表達可以顯著加速創(chuàng)口的愈合，而且在Heregulin存在的情況下這種促進作用更為明顯。實驗采用以基質膠為基礎的三維細胞培養(yǎng)法探索Erbin對Her2陽性乳腺癌細胞侵襲能力的影響。實驗結果表明，對照細胞可以在三維細胞培養(yǎng)體系中形成邊緣規(guī)則的球形結構，而大部分(80％)的Er

17、bin低表達細胞在三維體系中形成邊緣極不規(guī)則且具有侵襲樣結構的球體。上述結果表明，在Her2陽性乳腺癌細胞中沉默Erbin表達，可增強細胞遷移和侵襲能力。為進一步探索此過程中的精確分子機制，在劃痕實驗中使用了AKT特異性的抑制劑GDC0941。Western-blot的結果表明，GDC0941可特異性抑制AKT的磷酸化，而不影響ERK的磷酸化。劃痕實驗的結果表明，GDC0941能夠顯著逆轉Erbin表達缺失對細胞遷移能力的影響，證實了A

18、KT的活化可能在此過程中發(fā)揮了重要作用。那么ERK作為Her2下游另一條重要的信號通路，它的激活是否也參與Erbin表達缺失誘導的細胞遷移能力增強呢？為了回答這一問題，本次實驗選用了ERK的特異性抑制劑PD184352。結果表明，PD184352它可以在不影響AKT磷酸化的前提下，特異性抑制ERK的磷酸化。劃痕實驗的結果表明，PD184352并不能逆轉敲低Erbin表達所誘導的細胞遷移。以上實驗結果表明，在Her2陽性的乳腺癌細胞中，E

19、rbin表達缺失以AKT信號通路依賴的方式促進Her2陽性乳腺癌細胞遷移及侵襲表型形成。
　　 4、敲低Erbin表達誘導AKT信號依賴的赫賽汀耐藥
　　 目前靶向Her2的治療性抗體-赫賽汀是Her2陽性乳腺癌的主要治療手段之一。然而赫賽汀耐藥是制約此藥物發(fā)揮療效及造成患者不良預后的重要原因。闡明赫賽汀耐藥的相關機制、發(fā)現(xiàn)預測及克服耐藥的分子靶標具有重要意義。應用不同濃度的赫賽汀分別處理表達對照shRNA及表達Erbi

20、nshRNA的MCF-7/Her2細胞。在連續(xù)刺激5天后，采用CCK8細胞增殖實驗，檢測了敲低Erbin表達對赫賽汀細胞增殖抑制效應的影響。實驗結果表明，在對照組細胞中，赫賽汀可顯著抑制細胞的增殖，并呈現(xiàn)出良好的量效關系。在敲低Erbin的MCF-7/Her2細胞中，赫賽汀雖然可以在一定程度上抑制細胞增殖并具有量效關系。但是與對照細胞相比，相同濃度赫賽汀對敲低Erbin的MCF-7/Her2細胞的增殖抑制率顯著降低。這提示，敲低Erbi

21、n表達可能誘導Her2陽性乳腺癌細胞對赫賽汀產生耐藥。為進一步排除此現(xiàn)象的細胞特異性，實驗中選取MDA-453細胞重復進行了上述實驗。實驗結果表明，敲低Erbin表達可誘導MDA-453細胞對赫賽汀產生耐藥。
　　 由于在二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)條件下，腫瘤細胞對藥物的敏感性可能存在差異。本次實驗應用細胞海綿(cellusponge)三維細胞培養(yǎng)法檢測了敲低Erbin表達對MDA-453細胞赫賽汀敏感性的影響。實驗結果顯示，赫賽汀可完

22、全抑制對照細胞在細胞海綿中的生長。而敲低Erbin表達不但可以增加MDA-453細胞在細胞海綿中的克隆體積，還可以誘導MDA-453細胞對赫賽汀產生耐藥。在接下來的實驗中，采用了軟瓊脂細胞克隆形成實驗進一步檢測了敲低Erbin表達對MDA-453細胞赫賽汀抗性的影響。實驗結果顯示，赫賽汀可顯著抑制對照細胞的錨定非依賴性生長，而在敲低Erbin的細胞中，這種抑制效應顯著減弱。此結果進一步支持了這一假設，即Erbin表達缺失可誘導Her2陽

23、性乳腺癌細胞對赫賽汀產生抗性。
　　 為進一步探索敲低Erbin表達誘導Her2陽性乳腺癌細胞赫賽汀抗性的分子機制，本次實驗檢測了AKT及ERK信號通路在敲低Erbin表達誘導赫賽汀耐藥過程中的作用。通過細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)，在對照細胞中赫賽汀可抑制AKT的誘導劑Heregulin誘導的細胞增殖。但是在敲低Erbin的細胞中，赫賽汀不能抑制Heregulin誘導的細胞增殖。AKT的抑制劑GDC0941可顯著逆轉由于敲低Erbin導致

24、的赫賽汀耐藥，而ERK特異性抑制劑PD184352不能逆轉敲低Erbin誘導的赫賽汀耐藥。這一結果提示，Erbin表達缺失主要通過誘導AKT信號的異常活化誘導Her2陽性乳腺癌細胞赫賽汀耐藥的發(fā)生。
　　 結論:
　　 1、在乳腺癌及Her2陽性乳腺癌組織中Erbin表達水平顯著下調
　　 2、在Her2陽性的乳腺癌細胞中Erbin負向調控了AKT信號通路。
　　 3、Erbin表達缺失以AKT信號通路依