Drosha基因和mir-15b-16-2在血管平滑肌細胞中的功能和分子機制研究.pdf

1、目的：
　　 心血管系統(tǒng)疾病是全球人類健康的最大威脅之一，影響心血管系統(tǒng)疾病的因素非常復雜。miRNA是近年來生物醫(yī)學研究的熱點，生命體的許多生理過程（包括疾病的發(fā)生）都與miRNA有關(guān)。因此，深入研究miRNA與心血管系統(tǒng)疾病的關(guān)系將有助于人們揭示心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生機理。miRNA是長度22nt左右的非編碼小RNA，通過與多種靶基因mRNA的3'UTR不完全互補結(jié)合，從而降解靶基因，達到對這些基因負向調(diào)控的目的，調(diào)節(jié)機體相應

2、的生理功能。在miRNA成熟的過程中，有三種關(guān)鍵酶的參與，其中Drosha與DGCR8結(jié)合后，在細胞核內(nèi)將pri-miRNA加工成為pre-miRNA，然后pre-miRNA在細胞漿中由Dicer酶加工成為成熟的miRNA。為深入研究miRNA在血管平滑肌細胞中的功能，本課題制備了Drosha基因在血管平滑肌細胞中條件性敲除小鼠，并且利用腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體技術(shù)，構(gòu)建體外培養(yǎng)的小鼠血管平滑肌細胞中Drosha基因敲除和抑制的模型，在體

3、內(nèi)和體外分別驗證Drosha基因在血管平滑肌細胞中缺失后，動物整體發(fā)育、血管發(fā)育情況，以及對血管平滑肌細胞功能的影響，并且闡述其分子機制。本課題亦選擇mir-15b/16-2為研究對象，制備了mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠，并進行血壓測定，分離出mir-15b/16-2過表達的大鼠血管平滑肌細胞，并且利用慢病毒技術(shù)，在小鼠血管平滑肌細胞中抑制mir-16的表達，進行相關(guān)表型和分子機制研究。
　　 方法：
　　 第一章

4、Drosha基因在血管平滑肌細胞中的功能和分子機制研究血管平滑肌條件性Drosha基因敲除小鼠的制備:通過Droshaloxp/loxp/SM22-Cre×Droshaloxp/+/SM22-Cre或 Droshaloxp/+/SM22-Cre×Droshaloxp/+/SM22-Cre的繁殖模式，獲得Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠，提取尾組織DNA進行PCR反應檢測新生小鼠基因型，檢查繁殖母鼠陰道栓，當日檢

5、查有陰道栓者為胚胎期E0.5天，取E12.5、E13.5、E14.5和E15.5天的懷孕母鼠，皮下注射氯胺酮和賽拉嗪麻醉后頸椎脫臼處死，70％酒精消毒后，取胚胎卵黃囊，提取基因組DNA進行PCR反應檢測基因型以確定Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚胎。體外培養(yǎng)小鼠血管平滑肌細胞中Drosha基因的敲除:分離基因型為Droshaloxp/loxp的成年小鼠血管平滑肌細胞，經(jīng)過SV40質(zhì)粒轉(zhuǎn)染永生化之后，加入表達C

6、re酶和GFP的腺病毒，感染細胞24小時以上，能觀察到GFP綠色熒光者為Cre酶表達陽性細胞，體外細胞水平上敲除Drosha基因。體外培養(yǎng)小鼠血管平滑肌細胞中Drosha基因的抑制:利用小鼠血管平滑肌細胞系和逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的Drosha基因shRNA，在正常小鼠血管平滑肌細胞中沉默Drosha基因。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝:脂質(zhì)體法將pCMV-VSVG和shRNA載體共轉(zhuǎn)染至GD-293細胞系包裝病毒，轉(zhuǎn)染后60h收集上清，25000g，9

7、0min低溫超速離心法純化病毒。將病毒和polybrene(1 ul/mlDMEM)加入在50％-60％生長密度的細胞中，培養(yǎng)24h后加入3ug/ml的嘌呤霉素進行篩選，具有嘌呤霉素抗性者為Drosha基因抑制陽性細胞。Drosha基因敲除小鼠胚胎臍動脈血管厚度的比較和血管平滑肌細胞增殖能力的測定:E13.5天和E14.5天的懷孕母鼠，皮下注射氯胺酮和賽拉嗪麻醉后頸椎脫臼處死，70％酒精消毒后，取正常和Droshaloxp/loxp/S

8、M22-Cre敲除型小鼠胚胎，去頭部和尾部，取軀干部固定于10％的福爾馬林，經(jīng)過脫水、透明和浸蠟等步驟，包埋后制成4ul切片，HE染色;另取E13.5天正常和Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚胎臍動脈血管切片，進行脫蠟和重新水化，抗原修復結(jié)束后， PCNA一抗和熒光標記二抗孵育后，熒光倒置顯微鏡觀察結(jié)果，拍照并進行計算陽性細胞比例。體外培養(yǎng)小鼠血管平滑肌細胞中Drosha基因的敲除或抑制后細胞增殖能力的測定:取

9、生長密度70％-90％體外培養(yǎng)正常和Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌細胞，制備蛋白樣品，進行PCNA的western blot檢測。Drosha基因敲除小鼠胚胎臍動脈血管平滑肌細胞標志性基因表達水平的測定:取E13.5天正常和Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚胎臍動脈血管切片進行SMA免疫熒光染色，比較二者的熒光強度;另取E13.5天正常和Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚

10、胎臍動脈血管，制備蛋白樣品，進行SMA，SM22和CNN1的westernblot檢測。體外培養(yǎng)小鼠血管平滑肌細胞中Drosha基因的敲除或抑制后細胞標志性基因表達水平的測定:取生長密度50％-70％體外培養(yǎng)正常和Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌細胞，4％多聚甲醛固定，SMA一抗和熒光標記二抗孵育后，熒光倒置顯微鏡觀察結(jié)果，拍照并進行熒光強度測定;并且制備蛋白樣品，進行SMA，SM22和CNN1的western blot檢測

11、。 Drosha基因敲除小鼠胚胎臍動脈血管信號蛋白p-ERK1/2和p-AKT表達水平的測定:取E13.5天正常和Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚胎臍動脈血管制備蛋白樣品，進行信號蛋白p-ERK1/2和p-AKT的western blot檢測。體外培養(yǎng)小鼠血管平滑肌細胞中Drosha基因的敲除或抑制后細胞信號蛋白p-ERK1/2和p-AKT表達水平的測定:取生長密度70％-90％體外培養(yǎng)正常和Drosha基因

12、敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌細胞制備蛋白樣品，進行信號蛋白p-ERK1/2和p-AKT的western blot檢測。Drosha基因敲除小鼠胚胎臍動脈血管miRNA表達譜的測定:利用TRIZOL法提取E13.5天正常和Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚胎臍動脈總RNA，RNeasyMinElute Cleanup Kit進一步純化，RNA純度和完整度通過AgilentBioanalyzer檢測。利用Affym

13、etrixGeneChipmiRNA arrays進行miRNA微陣列表達譜測定。取1ug總RNA樣品，利用GenisphereFlashTag HSR kit進行polyA加尾，標記后的RNA與AffymetrixmiRNA array1.0.Chips雜交，洗脫，在FluidicStation450系統(tǒng)中染色，獲取圖像。數(shù)據(jù)分析選取正常和cKO小鼠胚胎臍動脈血管中變化2倍以上的miRNA。成熟的miRNA序列從miRBase中獲得，

14、選取成熟miRNA序列的2-7個堿基作為種子區(qū)，小鼠基因組序列中的3'UTR序列由UCSC table browser中獲得，利用TargetScan6.2的PERL碼預測所選miRNA的種子區(qū)與小鼠基因組3'UTR序列的互補位點。選取3'UTR序列有一個以上miRNA結(jié)合的基因進行功能相關(guān)研究，利用DAVID v6.7程序預測與靶基因相關(guān)的信號通路，通過DAVID計算Gene Ontology categories和KEGG數(shù)據(jù)庫中信

15、號通路的Fisher exact P value，GO categoteis中P值小于5.00E-07的屬于enriched型的，信號通路中P值小于1.00E-04有顯著性。Drosha基因敲除小鼠胚胎臍動脈血管內(nèi)皮細胞標志基因CD31表達水平的測定:取E14.5天正常和Droshaloxp/loxp/SM22-Cre敲除型小鼠胚胎臍動脈血管進行免疫熒光染色，并制備蛋白樣品，進行血管內(nèi)皮細胞標志基因CD31的western blot檢測

16、。
　　 第二章Mir-15b/16-2在血管平滑肌細胞中的功能和分子機制研究Mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠的制備:4-5周齡的雌性SD大鼠，皮下注射孕馬血清(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)進行超數(shù)排卵，與雄性SD大鼠合籠，次日上午檢查雌性大鼠陰道栓，收集單細胞期胚胎。將mir-15b/16-2過表達的慢病毒載體注射到單細胞期胚胎的卵周隙，在KSOM培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，當發(fā)育到二細胞期的時候，移植到假孕雌性SD大鼠輸

17、卵管中，縫合后送入動物飼養(yǎng)室。剪取新生大鼠尾組織1-2mm，置于熒光倒置顯微鏡下觀察，GFP表達陽性者為轉(zhuǎn)基因型大鼠;GFP表達陰性著為野生型大鼠。轉(zhuǎn)基因大鼠的繁殖模式為:野生型（♂）×轉(zhuǎn)基因型（♀）或轉(zhuǎn)基因型(♂)×野生型（♀）;進一步進行PCR反應驗證，有特異性條帶者為轉(zhuǎn)基因型大鼠。Mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠血壓的測定:皮下包埋法持續(xù)14天給予野生型和mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠血管緊張素Ⅱ，非侵入式血壓測定儀測定第0

18、天、第1天、第4天、第7天、第10天和第13天血壓，并檢測了相關(guān)指標。Mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠血管平滑肌細胞肥大程度的測定:分離和培養(yǎng)成年野生型和Mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠血管平滑肌細胞，進行細胞SMA免疫熒光染色和F-actin熒光染色，比較兩種細胞的面積。Mir-15b/16-2過表達后血管平滑肌細胞中MEK1和MEK4基因表達水平的測定:取生長密度70％-90％野生型和Mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠血管平滑肌

19、細胞，制備蛋白樣品，進行MEK1和MEK4的western blot檢測。Mir-15b/16-2過表達后血管平滑肌細胞中信號蛋白p-ERK1/2和p-P38表達水平的測定:取生長密度70％-90％野生型和Mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠血管平滑肌細胞，制備蛋白樣品，進行p-ERK1/2和p-P38的western blot檢測。體外培養(yǎng)小鼠血管平滑肌細胞中mir-16的抑制:構(gòu)建anti-mir-16慢病毒載體，結(jié)合輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染2

20、93T細胞，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)48-72h，收集上清，25000rpm，4℃超速低溫離心2h濃縮病毒，重懸于DMEM培養(yǎng)基中，分裝后保存于-80℃超低溫冰箱，將病毒和polybrene(1ul/mlDMEM)加入在50％-60％生長密度的細胞中，培養(yǎng)24h后加入3ug/ml的嘌呤霉素進行篩選，具有嘌呤霉素抗性者為mir-16表達抑制的陽性細胞。mir-16抑制后小鼠血管平滑肌細胞增殖能力的測定:取生長密度70％左右體外培養(yǎng)mi

21、r-16抑制后的小鼠血管平滑肌細胞，進行BrdU的免疫熒光染色，并且制備蛋白樣品，進行PCNA的western blot檢測。mir-16抑制后小鼠血管平滑肌細胞遷移能力的測定:細胞培養(yǎng)用六孔板中加入對照組和mir-16抑制后的小鼠血管平滑肌細胞，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)48h，待細胞單層生長鋪滿孔面，用200ul無菌槍頭劃過細胞，用PBS輕輕吹洗去脫落的細胞碎片，測定劃痕距離。繼續(xù)放入37℃，5％CO2細胞培養(yǎng)箱中，24h后分別測

22、定劃痕距離。mir-16抑制后小鼠血管平滑肌細胞中信號蛋白p-ERK1/2和p-P38表達水平的測定:取生長密度50％-70％體外培養(yǎng)對照組和mir-16抑制后的小鼠血管平滑肌細胞，經(jīng)血管緊張素Ⅱ誘導后，制備蛋白樣品，進行p-ERK1/2和p-P38的western blot檢測。mir-16抑制后對小鼠血管平滑肌細胞細胞標志性基因表達水平的測定:取生長密度70％-90％體外培養(yǎng)對照組和mir-16抑制后的小鼠血管平滑肌細胞，制備蛋白樣

23、品，進行SMA，SM22和CNN1的western blot檢測，并且對對照組和mir-16抑制后的小鼠血管平滑肌細胞進一步進行CNN1免疫熒光染色。
　　 結(jié)果：
　　 第一章Drosha基因在血管平滑肌細胞中的功能和分子機制研究血管平滑肌細胞中Drosha基因敲除后，胚胎臍動脈血管中Drosha基因表達水平降低，小鼠胚胎死亡時間為E13.5天和E14.5天之間。E13.5天cKO胚胎卵黃囊血管分布比正常胚胎少，E14

24、.5天后則完全消失;E13.5天cKO胚胎表型與正常胚胎差別不大，E14.5天cKO胚胎肝臟嚴重出血，胚胎死亡。Drosha基因敲除胚胎胸主動脈血管厚度均比正常胚胎小。E13.5天Drosha基因敲除胚胎比正常胚胎胸主動脈血管PCNA陽性細胞比例顯著降低，western blot結(jié)果顯示，Drosha基因敲除胚胎比正常胚胎胸主動脈血管PCNA表達水平降低。E13.5天Drosha基因敲除胚胎比正常胚胎胸主動脈血管SMA免疫熒光強度顯著降

25、低，western blot結(jié)果顯示，Drosha基因敲除胚胎比正常胚胎胸主動脈血管SMA、SM22和CNN1表達水平均降低。E13.5天Drosha基因敲除胚胎與正常胚胎胸主動脈血管western blot結(jié)果顯示，Drosha基因敲除胚胎比正常胚胎胸主動脈血管信號蛋白p-ERK1/2和p-AKT表達水平均降低。Western blot結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌細胞比正常小鼠血管平滑肌細胞PCNA表

26、達水平降低。體外培養(yǎng)Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌細胞比正常小鼠血管平滑肌細胞SMA免疫熒光強度顯著降低，western blot檢測結(jié)果顯示，Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌細胞SMA、SM22和CNN1表達水平降低。體外培養(yǎng)Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌細胞western blot檢測結(jié)果顯示，Drosha基因敲除或抑制后的小鼠血管平滑肌細胞信號蛋白p-ERK1/2和p-AKT表達水平均降低。

27、利用miRNA array的方法檢測正常和Drosha基因敲除胚胎血管平滑肌細胞中miRNA的表達譜，在670個小鼠miRNA探針中過濾掉低信號，獲得198個miRNA的array數(shù)據(jù)，其中104個在cKO胚胎的臍動脈血管中表達明顯降低，27個沒有明顯變化，67個表達上升。選取46種變化2倍以上（升高或降低）的miRNA，利用DAVID分析其3890種靶基因，獲得19個顯著的Enriched型的功能類型，其中最顯著的兩個功能類型是pho

28、sphoprotein(P-value=1.1×10-82)和alternative splicing(P-value=1.9×10-41)。通過分析KEGG信號通路，獲得變化較大的幾條信號通路，包括MAPK，WNT, actin-cytoskeleton調(diào)節(jié)通路等。
　　 第二章Mir-15b/16-2在血管平滑肌細胞中的功能和分子機制研究成功獲得mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠，其由血管緊張素Ⅱ誘導的血壓（收縮壓、舒張壓）

29、低于野生型，測得其它相關(guān)指標亦符合該趨勢。mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠血管平滑肌細胞可表達GFP綠色熒光，F(xiàn)-actin染色顯示其細胞面積小于野生型。與野生型相比，Mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠血管平滑肌細胞MEK1和MEK4免疫熒光強度顯著降低，western blot檢測MEK1和MEK4表達水平降低。westernblot檢測結(jié)果顯示，與野生型相比，Mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠血管平滑肌細胞中信號蛋白p-ERK1/

30、2和p-P38表達水平均降低。mir-16基因抑制后的小鼠血管平滑肌細胞中MEK1和MEK4基因表達水平升高。BrdU熒光染色結(jié)果顯示mir-16基因抑制后小鼠血管平滑肌細胞BrdU陽性細胞數(shù)比例顯著高于正常小鼠血管平滑肌細胞。mir-16基因抑制后，經(jīng)血管緊張素Ⅱ誘導的小鼠血管平滑肌細胞中信號蛋白p-ERK1/2和p-P38表達水平均升高。mir-16基因抑制后小鼠血管平滑肌細胞的劃痕修復能力與正常組相比顯著增強，與正常組相比，mir

31、-16基因抑制后小鼠血管平滑肌細胞中CNN1表達水平升高，而SMA和SM22表達水平無明顯變化。免疫熒光染色結(jié)果顯示，mir-16基因抑制后小鼠血管平滑肌細胞CNN1熒光強度顯著升高。
　　 結(jié)論：
　　 第一章Drosha基因在血管平滑肌細胞中的功能和分子機制研究成功制備Drosha基因在血管平滑肌細胞中條件性敲除小鼠。小鼠血管平滑肌細胞中敲除Drosha基因后，導致小鼠早期胚胎死亡，肝臟嚴重出血，血管發(fā)育遲緩，血管平

32、滑肌細胞增殖能力降低，標志基因SMA、SM22和CNN1表達降低，信號蛋白p-ERK1/2和p-AKT表達降低，血管內(nèi)皮細胞標志基因CD31表達降低，說明Drosha基因在血管平滑肌細胞中行使重要的功能，并且影響到血管內(nèi)皮細胞的功能。血管平滑肌細胞中Drosha基因的缺失導致miRNA表達譜的變化，一些與血管平滑肌功能相關(guān)的miRNA表達水平降低，引起了多個與血管平滑肌細胞生長和功能相關(guān)的信號通路改變。
　　 第二章Mir-15

33、b/16-2在血管平滑肌細胞中的功能和分子機制研究成功制備mir-15b/16-2轉(zhuǎn)基因大鼠，mir-15b/16-2可降低由血管緊張素Ⅱ誘導的大鼠血壓（收縮壓和收縮壓）。M ir-15b/16-2在大鼠血管平滑肌細胞中過表達之后，細胞肥大程度降低，MEK1和MEK4及其下游信號蛋白p-ERK1/2和p-P38表達水平降低;mir-16在小鼠平滑肌細胞中表達抑制之后，細胞增殖和遷移能力升高，MEK1和MEK4及其下游信號蛋白p-ERK1