穩(wěn)定表達的PVX P25蛋白對煙草病毒抗性及表型的影響.pdf

1、RNA沉默是普遍存在于真核生物體內(nèi)抵御外來核酸入侵的序列特異性降解機制。植物利用RNA沉默抵御病毒侵染，而病毒則通過編碼沉默抑制子干擾RNA沉默途徑。沉默抑制子針對RNA沉默途徑的不同環(huán)節(jié)起作用，通過對其沉默抑制方式的研究，可以深入了解RNA沉默機制及病毒、寄主互作規(guī)律，為利用RNA沉默培育抗病毒農(nóng)作物品種提供理論依據(jù)。P25是由馬鈴薯X病毒編碼的25kD蛋白，是一種較弱的RNA沉默抑制子，能夠協(xié)助病毒在細胞間運輸是PVX病毒的致病因子

2、。本研究以非翻譯PVYNCP轉基因抗病毒煙草為母本，P25轉基因煙草為父本，進行常規(guī)雜交，篩選攜帶CP和P25基因的雙轉基因煙草子代，接種PVYN病毒檢測其抗病性。通過抗病性分析和分子雜交，探討穩(wěn)定表達的P25蛋白對RNA沉默介導抗病性的影響；并對P25轉基因煙草生長發(fā)育異常及相關miRNA表達變化進行初步探討。主要研究結果如下：
　　 (1)P25、PVYNCP雙轉基因煙草的獲得和鑒定。分別播種P25和PVYNCP轉基因煙草種

3、子，經(jīng)PCR和Westernblot檢測篩選穩(wěn)定表達P25的轉基因植株；PCR擴增結合PVYN病毒接種篩選PVYNCP轉基因抗病植株。利用穩(wěn)定表達P25的轉基因煙草為父本，PVYNCP基因介導的PVY抗病毒轉基因煙草去雄后與之進行常規(guī)雜交，所得子代經(jīng)過PCR和Western blot檢測，成功篩選到攜帶P25和PVYNCP基因的雙轉基因植株。
　　 (2)P25、PVYNCP雙轉基因煙草的抗病性分析。雙轉基因煙草生長至4-5片真

4、葉時接種PVYN病毒，接種10天后所有雙轉基因植株均表現(xiàn)系統(tǒng)感病，出現(xiàn)典型褪綠斑癥狀。ELISA檢測表明，在感病植株中存在高滴度的PVYN病毒。Northernblot分析表明，雙轉基因植株中PVYNCPmRNA表達水平明顯高于發(fā)生RNA沉默的母本植株。以上結果表明，在植物體內(nèi)異源表達的P25蛋白仍能發(fā)揮其RNA沉默抑制功能，導致PVYNCP轉基因植株抗病性喪失，P25雖為弱沉默抑制子，但在強啟動子CaMV35S啟動下表達量較高，煙草轉

5、基因植株中表現(xiàn)出較強的沉默抑制能力。
　　 (3)P25轉基因煙草中與生長異常相關的生理指標的測定。研究過程中發(fā)現(xiàn)，與野生型煙草相比，相同生長期的P25轉基因煙草及P25、PVYNCP雙轉基因煙草均表現(xiàn)出葉片發(fā)黃、下部葉片提前枯萎等生長異?，F(xiàn)象，葉色由綠變黃和枯萎，通常是葉綠素降解的結果，而葉綠素分解是衰老的原發(fā)過程和標志，因此推測P25蛋白可能促使葉片衰老。我們分析比較了P25轉基因煙草與野生型煙草葉綠素含量及葉綠素降解密切相

6、關的兩種酶--超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)的活性。結果表明，P25轉基因煙草與野生型煙草相比，葉綠素含量降低54％，葉綠素a/葉綠素b明顯低于野生型煙草。SOD是機體內(nèi)天然存在的O-2清除因子，其活性下降導致O-2積累；而過氧化物酶(POD)參與了葉綠素的降解，其活性與衰老呈高度負相關。分析表明，與野生型煙草相比，P25轉基因煙草SOD的活性降低25％，POD活性提高2.5倍。另外還測定了與光合能力直接相關的一系列光合

7、指標，結果表明，與野生型煙草相比，P25轉基因煙草的凈光合速率(Pn)降低45％，蒸騰速率(EVAP)降低36％、氣孔導度(Gs)降低50％，而細胞間隙CO2濃度(Ci)僅降低3％，表明氣孔導度的降低和蒸騰速率的下降可能是導致凈光合速率降低的主要原因，而細胞間隙CO2濃度基本不變，自然狀態(tài)下，只有當氣孔導度與細胞間隙CO2濃度以相同的方式變化時，才能確定Pn的下降是氣孔限制造成的。所以我們認為P25轉基因煙草凈光合速率的降低是由非氣孔限

8、制造成。
　　 (4)P25轉基因煙草miRNA的表達量分析。miRNA參與生長發(fā)育相關基因的表達調(diào)控及細胞分化、增殖和凋亡等過程，影響著幾乎所有的信號通路，參與多種生理病理過程。與植物抗病毒siRNA沉默途徑一樣，miRNA途徑也受到病毒沉默抑制子的干擾。miRNA在加工上與siRNA共享著一些相似的蛋白和路徑，都是Dicer蛋白加工的產(chǎn)物，都需要解旋酶的參與，所結合的復合體siRISC和miRISC都包含有至少一個Agona

9、ute家族蛋白。在miRNA途徑上起重要作用的基因DCL1和AGO1，各自受到miR162和miR168的負調(diào)控。利用qRT-PCR比較分析了miR162、miR168的表達水平，與野生型煙草相比，P25轉基因煙草的miR162、miR168的表達水平分別提高2.8倍和3.7倍。說明P25作為沉默抑制子干擾siRNA途徑的同時也干擾miRNA途徑。P25轉基因煙草中調(diào)控DCL1表達的miR162的積累量顯著增加，推測P25可能對DCL1

10、的表達產(chǎn)生影響。利用qRT-PCR比較分析轉基因和野生型煙草中4種與生長發(fā)育密切相關的miR156，miR165，miR167和miR171的表達水平，它們分別調(diào)控植物的開花，發(fā)育模型，激素應答和轉錄因子，與野生型煙草相比，P25轉基因煙草中，miR156、miR165、miR167、miR171的表達水平分別提高2.0倍、3.2倍、4.7倍和1.8倍，這表明，P25蛋白普遍影響與生長發(fā)育有關的miRNA的表達水平，產(chǎn)生生長發(fā)育異常如提