穩(wěn)定表達的PVX P25蛋白對煙草病毒抗性及表型的影響.pdf

1、RNA沉默是普遍存在于真核生物體內(nèi)抵御外來核酸入侵的序列特異性降解機制。植物利用RNA沉默抵御病毒侵染，而病毒則通過編碼沉默抑制子干擾RNA沉默途徑。沉默抑制子針對RNA沉默途徑的不同環(huán)節(jié)起作用，通過對其沉默抑制方式的研究，可以深入了解RNA沉默機制及病毒、寄主互作規(guī)律，為利用RNA沉默培育抗病毒農(nóng)作物品種提供理論依據(jù)。P25是由馬鈴薯X病毒編碼的25kD蛋白，是一種較弱的RNA沉默抑制子，能夠協(xié)助病毒在細胞間運輸是PVX病毒的致病因子

2、。本研究以非翻譯PVYNCP轉(zhuǎn)基因抗病毒煙草為母本，P25轉(zhuǎn)基因煙草為父本，進行常規(guī)雜交，篩選攜帶CP和P25基因的雙轉(zhuǎn)基因煙草子代，接種PVYN病毒檢測其抗病性。通過抗病性分析和分子雜交，探討穩(wěn)定表達的P25蛋白對RNA沉默介導(dǎo)抗病性的影響；并對P25轉(zhuǎn)基因煙草生長發(fā)育異常及相關(guān)miRNA表達變化進行初步探討。主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)P25、PVYNCP雙轉(zhuǎn)基因煙草的獲得和鑒定。分別播種P25和PVYNCP轉(zhuǎn)基因煙草種

3、子，經(jīng)PCR和Westernblot檢測篩選穩(wěn)定表達P25的轉(zhuǎn)基因植株；PCR擴增結(jié)合PVYN病毒接種篩選PVYNCP轉(zhuǎn)基因抗病植株。利用穩(wěn)定表達P25的轉(zhuǎn)基因煙草為父本，PVYNCP基因介導(dǎo)的PVY抗病毒轉(zhuǎn)基因煙草去雄后與之進行常規(guī)雜交，所得子代經(jīng)過PCR和Western blot檢測，成功篩選到攜帶P25和PVYNCP基因的雙轉(zhuǎn)基因植株。
　　 (2)P25、PVYNCP雙轉(zhuǎn)基因煙草的抗病性分析。雙轉(zhuǎn)基因煙草生長至4-5片真

4、葉時接種PVYN病毒，接種10天后所有雙轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)系統(tǒng)感病，出現(xiàn)典型褪綠斑癥狀。ELISA檢測表明，在感病植株中存在高滴度的PVYN病毒。Northernblot分析表明，雙轉(zhuǎn)基因植株中PVYNCPmRNA表達水平明顯高于發(fā)生RNA沉默的母本植株。以上結(jié)果表明，在植物體內(nèi)異源表達的P25蛋白仍能發(fā)揮其RNA沉默抑制功能，導(dǎo)致PVYNCP轉(zhuǎn)基因植株抗病性喪失，P25雖為弱沉默抑制子，但在強啟動子CaMV35S啟動下表達量較高，煙草轉(zhuǎn)

5、基因植株中表現(xiàn)出較強的沉默抑制能力。
　　 (3)P25轉(zhuǎn)基因煙草中與生長異常相關(guān)的生理指標(biāo)的測定。研究過程中發(fā)現(xiàn)，與野生型煙草相比，相同生長期的P25轉(zhuǎn)基因煙草及P25、PVYNCP雙轉(zhuǎn)基因煙草均表現(xiàn)出葉片發(fā)黃、下部葉片提前枯萎等生長異?，F(xiàn)象，葉色由綠變黃和枯萎，通常是葉綠素降解的結(jié)果，而葉綠素分解是衰老的原發(fā)過程和標(biāo)志，因此推測P25蛋白可能促使葉片衰老。我們分析比較了P25轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草葉綠素含量及葉綠素降解密切相

6、關(guān)的兩種酶--超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)的活性。結(jié)果表明，P25轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草相比，葉綠素含量降低54％，葉綠素a/葉綠素b明顯低于野生型煙草。SOD是機體內(nèi)天然存在的O-2清除因子，其活性下降導(dǎo)致O-2積累；而過氧化物酶(POD)參與了葉綠素的降解，其活性與衰老呈高度負相關(guān)。分析表明，與野生型煙草相比，P25轉(zhuǎn)基因煙草SOD的活性降低25％，POD活性提高2.5倍。另外還測定了與光合能力直接相關(guān)的一系列光合

7、指標(biāo)，結(jié)果表明，與野生型煙草相比，P25轉(zhuǎn)基因煙草的凈光合速率(Pn)降低45％，蒸騰速率(EVAP)降低36％、氣孔導(dǎo)度(Gs)降低50％，而細胞間隙CO2濃度(Ci)僅降低3％，表明氣孔導(dǎo)度的降低和蒸騰速率的下降可能是導(dǎo)致凈光合速率降低的主要原因，而細胞間隙CO2濃度基本不變，自然狀態(tài)下，只有當(dāng)氣孔導(dǎo)度與細胞間隙CO2濃度以相同的方式變化時，才能確定Pn的下降是氣孔限制造成的。所以我們認為P25轉(zhuǎn)基因煙草凈光合速率的降低是由非氣孔限

8、制造成。
　　 (4)P25轉(zhuǎn)基因煙草miRNA的表達量分析。miRNA參與生長發(fā)育相關(guān)基因的表達調(diào)控及細胞分化、增殖和凋亡等過程，影響著幾乎所有的信號通路，參與多種生理病理過程。與植物抗病毒siRNA沉默途徑一樣，miRNA途徑也受到病毒沉默抑制子的干擾。miRNA在加工上與siRNA共享著一些相似的蛋白和路徑，都是Dicer蛋白加工的產(chǎn)物，都需要解旋酶的參與，所結(jié)合的復(fù)合體siRISC和miRISC都包含有至少一個Agona

9、ute家族蛋白。在miRNA途徑上起重要作用的基因DCL1和AGO1，各自受到miR162和miR168的負調(diào)控。利用qRT-PCR比較分析了miR162、miR168的表達水平，與野生型煙草相比，P25轉(zhuǎn)基因煙草的miR162、miR168的表達水平分別提高2.8倍和3.7倍。說明P25作為沉默抑制子干擾siRNA途徑的同時也干擾miRNA途徑。P25轉(zhuǎn)基因煙草中調(diào)控DCL1表達的miR162的積累量顯著增加，推測P25可能對DCL1

10、的表達產(chǎn)生影響。利用qRT-PCR比較分析轉(zhuǎn)基因和野生型煙草中4種與生長發(fā)育密切相關(guān)的miR156，miR165，miR167和miR171的表達水平，它們分別調(diào)控植物的開花，發(fā)育模型，激素應(yīng)答和轉(zhuǎn)錄因子，與野生型煙草相比，P25轉(zhuǎn)基因煙草中，miR156、miR165、miR167、miR171的表達水平分別提高2.0倍、3.2倍、4.7倍和1.8倍，這表明，P25蛋白普遍影響與生長發(fā)育有關(guān)的miRNA的表達水平，產(chǎn)生生長發(fā)育異常如提