九孔鮑cDNA文庫的構(gòu)建、四種重要免疫相關(guān)蛋白的發(fā)現(xiàn)及其功能研究.pdf

1、鮑是一類重要的經(jīng)濟貝類品種，但是近年來由于環(huán)境污染和病害的發(fā)生而導致鮑的產(chǎn)量大幅度下降。為了探索研究鮑免疫反應(yīng)相關(guān)機制，為鮑病害防治提供理論基礎(chǔ)，本研究構(gòu)建了九孔鮑血淋巴細胞cDNA文庫，首次篩選出了4個尚未報道的鮑免疫反應(yīng)相關(guān)基因：組氨酸核苷結(jié)合蛋白、胞嘧啶核苷脫氨酶、泛素連接酶Rbx1和胸腺肽β。并利用現(xiàn)代生物信息學分析手段，分子生物學、免疫學及細胞生物學等技術(shù)對這4個鮑新基因的結(jié)構(gòu)和功能進行了研究。
　　 1.構(gòu)建了九孔鮑

2、血淋巴細胞cDNA文庫
　　 共得到310個EST序列，其中包含18個鮑新基因全長序列。通過生物信息學軟件分析，這些基因分別涉及到鮑的細胞代謝和生長、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、物質(zhì)合成、免疫反應(yīng)等。并把相關(guān)基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫。
　　 2.九孔鮑組氨酸核苷結(jié)合蛋白的鑒定與功能和機制的研究
　　 九孔鮑組氨酸核苷結(jié)合蛋白( ab-HINT)cDNA全長為616bp，氨基酸序列與哺乳動物HINT有較高的相似度，并且包含

3、三個保守的活性位點區(qū)域。組織表達分布研究表明：ab-HINT在鮑不同組織中均有表達，表現(xiàn)了其功能的多樣性，并且在鮑血淋巴細胞和鰓中的表達水平要明顯高于其他組織，暗示了ab-HINT在鮑免疫反應(yīng)中起到一定的作用。另外，LPS和Poly I：C的刺激均能誘導ab-H1NT的表達水平上升，進一步說明了ab-HINT在鮑免疫反應(yīng)中的作用。為了進一步研究ab-HINT的生物學活性及生理學作用，表達和純化了ab-HINT蛋白，并利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定。分

4、析型超速離心機分析結(jié)果指明該ab-HINT是一個同源二聚體。同時，高效液相色譜分析表明ab-H1NT蛋白能夠水解AMP-NH2。利用制備的抗體，用免疫組化和免疫熒光的方法，研究了ab-HINT在鮑組織細胞中的表達定位。在這些研究的基礎(chǔ)上，我們進一步探索研究了ab-HINT對鮑血淋巴細胞及腫瘤細胞的凋亡作用及其作用機制。結(jié)果表明：ab-H1NT能夠誘導鮑血淋巴細胞凋亡，有可能是通過凋亡調(diào)控因子P53來實現(xiàn)的。另外，ab-HINT能夠增加腫

5、瘤細胞凋亡比例，該凋亡通路可能是通過上調(diào)P53的表達，同時伴隨著抗凋亡蛋白Bcl-2的下調(diào)和促凋亡蛋白Bax的上調(diào)來實現(xiàn)的。3.九孔鮑胞嘧啶核苷脫氨酶的鑒定及功能研究
　　 九孔鮑胞嘧啶核苷脫氨酶( ab-CDA)eDNA全長為1752bp，氨基酸序列中包含兩個保守的活性位點區(qū)域和一個保守的半胱氨酸/組氨酸殘基。序列比對及進化樹分析表明ab-CDA屬于同源四聚體家族。組織表達分布研究表明：ab-CDA在鮑不同組織中均有表達，并且

6、在鮑血淋巴細胞中的表達水平顯著高于其他組織。同時，LPS和Poly I：C的刺激均能誘導ab-CDA的表達水平上升，說明了ab-CDA在鮑免疫反應(yīng)中的作用。為了進一步研究ab-CDA的生物學功能，表達和純化了ab-CDA蛋白，并用質(zhì)譜技術(shù)鑒定。分光光度計分析表明該蛋白具有胞嘧啶核苷脫氨酶活性，同時，利用免疫組化的方法，研究了ab-CDA在鮑組織細胞中的表達定位，結(jié)果表明：ab-CDA在胞質(zhì)和胞核均有表達。4.九孔鮑泛素連接酶Rbx1的鑒

7、定及功能研究
　　 九孔鮑泛素連接酶Rbx1(ab-Rbx1)的cDNA全長為509bp，氨基酸序列與其他Rbx1同源物有較高的相似度，并且ab-Rbx1氨基酸序列中含有Rbx1蛋白家族的特征區(qū)域ring box序列。組織表達分布研究表明：ab-Rbx1在鮑不同組織中均有表達，并且在鮑血淋巴細胞中的表達水平相對高于其他組織。同時，PHA的刺激能顯著誘導ab-Rbx1的表達水平上升。說明了ab-Rbx1具有廣泛的生物學功能，其中在

8、免疫反應(yīng)中起到一定的作用。為了進一步研究ab-Rbx1功能，表達和純化了ab-Rbx1蛋白，并利用免疫組化和免疫熒光的方法，研究了ab-Rbx1在鮑組織細胞中的表達定位，結(jié)果表明ab-Rbx1在細胞質(zhì)和細胞胞核均有一定表達，進一步說明了ab-Rbx1功能的多樣性。另外，體外泛素化檢測分析表明：ab-Rbx1具有泛素連接酶活性，并且這種活性依賴ATP，表明了泛素化修飾在軟體動物鮑中的保守性。5.九孔鮑胸腺肽β的鑒定與表達分析研究
　

9、　 九孔鮑胸腺肽β(ab-TMSB)的cDNA全長為499bp，氨基酸序列與其他胸腺肽β同源物具有較高的相似性，并且序列中包含保守的肌動蛋白結(jié)合區(qū)，該區(qū)域是胸腺肽β蛋白家族的特征區(qū)。組織表達分布研究表明：ab-TMSB在鮑各檢測的組織中均有一定的表達，表明ab-TMSB在鮑中具有廣泛的生物學作用。并且ab-TMSB在血淋巴細胞中的表達要顯著高于其他檢測組織，暗示了ab-TMSB在鮑免疫反應(yīng)中發(fā)揮一定的作用。進一步用實時定量PCR檢測了