腫瘤個(gè)體化治療基因檢測教程_第1頁
已閱讀1頁,還剩66頁未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、腫瘤個(gè)體化治療基因檢測教程,,教程目錄,第一章 病理常規(guī)操作第二章 樣本前處理(申請單填寫、標(biāo)本類型、標(biāo)本評估及登記等)第三章 樣本預(yù)處理(DNA、RNA提取及質(zhì)量評估)第四章 基因操作(測序、片段分析及Q-PCR)第五章 結(jié)果解讀及診斷報(bào)告出具第六章 資料匯總,資料庫建立,第一章 病理常規(guī)操作,1. 病理樣本的接收2. 組織固定3. 取材4. 包埋5. 組織石蠟切片6. HE染色,1. 病理樣本的接收,,1.首先

2、核對病理申請單與標(biāo)本上的紅色號碼是否一致。2.核查病理申請單上寫明的送檢標(biāo)本及數(shù)目是否與實(shí)際送檢標(biāo)本一致。3.觀察送檢標(biāo)本的大小及固定液比例是否合適。(1)穿刺活檢及纖支鏡所取的小標(biāo)本,4%中性甲醛(10%中性福爾馬林)固定組織的量應(yīng)在6~10倍。(2)對于較大的手術(shù)切除標(biāo)本,應(yīng)及時(shí)切開固定;核對后將病理申請單和標(biāo)本編上病理標(biāo)本號。4.將病人姓名、性別、年齡、病歷號、科別、臨床診斷、部位、標(biāo)本來源、標(biāo)本例數(shù)等逐項(xiàng)錄入電腦存儲。5

3、.作為病理資料不僅要做好計(jì)算機(jī)錄入工作,還須進(jìn)行文字登記,以便病理檔案長期保存。,2. 組織固定,臨床醫(yī)師切取標(biāo)本后,應(yīng)盡快將標(biāo)本置于盛有足夠量固定液的容器內(nèi),盡量避免可能出現(xiàn)固定不及時(shí)或不充分導(dǎo)致標(biāo)本干涸或腐敗,無法進(jìn)行切片制作。添加的量應(yīng)6~10倍于標(biāo)本體積.,3. 取材及其后期處理,病理科病理醫(yī)生取材核對標(biāo)本及其標(biāo)志與申請單是否一致。按照病理取材規(guī)范選取病變及正常組織。對送檢標(biāo)本進(jìn)行大體描述。取材后的標(biāo)本保存至少兩周。放

4、入自動(dòng)脫水機(jī)進(jìn)行水洗-脫水-透明-浸蠟前處理。,4.包埋,先將熔化的石蠟傾入模具,再用加熱的鑷子夾取已經(jīng)浸蠟的組織塊,注意:特定的制定面或最下面向下埋入熔蠟。注意標(biāo)本的編號和標(biāo)本要對準(zhǔn),防止污染。為下一步切片準(zhǔn)備,提供介質(zhì)。,5.切片,刀片鋒利,組織塊預(yù)冷。切5-10um的連續(xù)組織切片,置于玻片上。撈片,烘干。,6.HE染色,蘇木素-伊紅染色。蘇木素染細(xì)胞核(核酸),伊紅染細(xì)胞質(zhì)(蛋白),使組織細(xì)胞對比清晰,便于顯微鏡下觀察。

5、主要流程:二甲苯脫蠟-梯度酒精脫二甲苯-蘇木素染色-分化、返藍(lán)-伊紅-梯度酒精、二甲苯-封片。,《臨床技術(shù)操作規(guī)范病理學(xué)分冊》 2004年第1版,第二章 標(biāo)本前處理,一、申請單填寫1、登記患者基本情況,包括姓名、性別、年齡、送檢單位、床位、門診號/住院號、送檢日期、取材部位、病理診斷、標(biāo)本病理號等2、患者簽署知情同意書,留下聯(lián)系方式3、患者病史及臨床情況,患者病史及臨床情況登記事項(xiàng),有無手術(shù)(穿刺標(biāo)本)手術(shù)時(shí)間 術(shù)前術(shù)后有無

6、化療,化療方案及化療效果及毒副作用(相關(guān)血項(xiàng)指標(biāo)、胃腸反應(yīng)、皮膚反應(yīng)、神經(jīng)反應(yīng)等),治療的單位。癌癥有無轉(zhuǎn)移,復(fù)發(fā)或者不能切除相關(guān)病史及家族史,,,送檢標(biāo)本種類:,外周全血;胸腹水;痰;尿新鮮(冰凍)標(biāo)本;內(nèi)鏡活檢標(biāo)本;手術(shù)標(biāo)本蠟塊或切片,新鮮標(biāo)本用10%中性福爾馬林固定或用RNAlater浸泡20分鐘以上(常溫可保存10天)外借病理蠟塊,常規(guī)病理大小即可常規(guī)石蠟切片(10張白片),5-10um,常溫送檢,送檢標(biāo)本要求:,

7、樣本評估,血:保存溫度、時(shí)間,是否凝固胸腹水、尿及痰:涂片HE染色觀察結(jié)果是否有癌細(xì)胞蠟塊或白片:組織保存時(shí)間、福爾馬林固定時(shí)間、組織大小、有無癌細(xì)胞,將申請單登記入冊,登記基因檢測申請?zhí)枴⑿彰?、送檢單位、病理號、檢測項(xiàng)目,腫瘤個(gè)體化治療基因檢測項(xiàng)目,腫瘤個(gè)體化治療基因檢測項(xiàng)目,腫瘤個(gè)體化治療基因檢測項(xiàng)目,腫瘤個(gè)體化治療基因檢測項(xiàng)目,,石蠟白片前處理1.烤片(90-95℃,0.5小時(shí))2.脫蠟(過夜,最后一缸換新二甲苯)3

8、.HE染色4.鏡下區(qū)分選擇腫瘤組織4.刮片5.消化腫瘤組織(200μlTL+20μlOB酶,55℃2-3h消化時(shí)間視具體情況定),第三章 基因檢測前處理,HE染色結(jié)果,,DNA的提取,1.血DNA的提取2.石蠟組織DNA的提取,血液DNA提取,250μl抗凝血加入250μl Buffer BL和25μl OB酶,70℃孵育15分鐘。加入260μl無水乙醇震蕩混合約20秒。取上清轉(zhuǎn)入收集柱中,12000rpm離心2分鐘。

9、將收集柱置一新收集管上,加入500μl HB solution,12000rpm離心2分鐘。加入700μl wash Buffer,12000rpm離心2分鐘。空甩離心,12000rpm2分鐘。將收集柱置一新1.5ml離心管上,加入50μl 70℃預(yù)熱的洗脫液,靜置5分鐘,12000rpm離心4分鐘洗脫,即為DNA模板。瓊脂糖電泳檢測提取DNA質(zhì)量(或用分光光度計(jì)定量并記錄)。,Omega Blood DNA kit proto

10、col,石蠟DNA提取,在消化充分的組織中加入220μl BUffer BL,震蕩混合,于70℃孵育。加入220μl無水乙醇震蕩混合約20秒。取上清轉(zhuǎn)入收集柱中,12000rpm離心2分鐘。將收集柱置一新收集管上,加入500μl HB solution,12000rpm離心2分鐘。加入700μl wash Buffer,12000rpm離心2分鐘??账﹄x心,12000rpm2分鐘。將收集柱置一新1.5ml離心管上,加入50μ

11、l70℃預(yù)熱的洗脫液,靜置5分鐘,12000rpm離心4分鐘洗脫,即為DNA模板。瓊脂糖電泳檢測提取DNA質(zhì)量(或用分光光度計(jì)定量并記錄)。,Omega Tissuse DNA kit protocol,電泳圖,,RNA的提取,1.石蠟組織RNA的提取2.血RNA的提取 (化療后需1200微升血→白細(xì)胞太少),1.石蠟組織RNA的提取,RNAlater樣本處理另注加入250μlbufferPKD和10μl的蛋白酶K,渦旋

12、混勻后,55°C孵育2-3h,80°C15min。然后加入500μl的bufferRBC,充分混勻。將溶液轉(zhuǎn)入gDNA Eliminator spin柱內(nèi),10000g離心30s,吸取收集管內(nèi)液體至新的離心管,重復(fù)操作直至溶液都過濾收集柱。在溶液內(nèi)加入1200μl無水乙醇,混勻,將溶液轉(zhuǎn)入RNeasy MinElute spin柱內(nèi),10000g離心15s,棄收集管內(nèi)液體。加入500μl buffer RPE

13、,10000g離心15min,棄收集管內(nèi)液體。加入500μl buffer RPE,10000g離心2min。小心將柱取出,放入一新的收集管內(nèi),最大速度離心5min(將柱蓋打開)將柱放入1.5ml收集管內(nèi),加入40-60μl無Rnase酶水,蓋上蓋子,室溫放置2min,最大速度離心1min洗脫RNA.,Qiagen RNEASY FFPE RNA kit protocol,2.血RNA的提取,300μl全血+1500μl 1

14、5; buffer ERL (150μl 10× ERL+1350μl H2O)混勻。同時(shí)做3管。冰上孵育10min,至半透明。450g 4℃,10min,棄上清。600μl 1× buffer ERL混勻,洗滌細(xì)胞。洗滌后合并3管液體。450g 4℃,10min,棄上清。600μl TRK裂解液+12μl β-巰基乙醇吹打混勻(可以暫時(shí)-70℃凍存)。加等體積70%乙醇,吹打混勻。將液體轉(zhuǎn)入HiBind

15、 RNA提取柱內(nèi)(<800μl/次),10000g離心1min,棄收集管內(nèi)液體,重復(fù)操作直至所有液體都過柱。加700μl RNA wash Buffer Ⅰ,10000g離心1min棄收集管內(nèi)液體。換新的收集管,加500μl RNA wash Buffer Ⅱ,10000g離心1min棄收集管內(nèi)液體。柱內(nèi)加500μl RNA wash Buffer Ⅱ,10000g離心1min棄收集管內(nèi)液體。12000g 空柱離心2min

16、。取一新的1.5ml離心管,在柱中央加入40μl洗脫液,12000g離心1min。核酸蛋白儀檢測提取RNA純度及濃度。-70℃保存RNA。,Omega Blood RNA kit protocol,,Quantifiler數(shù)據(jù)評估提取RNA質(zhì)量OD260/OD280 1.8~2.0: 純度好 > 2.1: 核酸降解 < 1.6: 蛋白質(zhì)污

17、染,第四章 基因操作,PCR擴(kuò)增(以K-ras為例),反應(yīng)體系為:10×buffer dNTP(2mM) Mg2+TaqGenome DNAPrimer-F(10μM)Primer-R(10μM)H2O,2μl 2μl0.75μl0.25μl1μl0.4μl0.4μl13.2μl,,Total

18、 20μl,PCR反應(yīng)條件: 置PCR擴(kuò)增儀中95℃預(yù)變性15min,用TouchdownPCR,94℃變性50秒,63℃-58℃退火1分鐘,72℃延伸1分鐘,共循環(huán)10次,94℃變性50秒,57℃退火1分鐘,72℃延伸1分鐘,共循環(huán)30次,最后于72℃延伸10分鐘。,電泳圖,用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否為單一目的條帶。,PCR產(chǎn)物純化,1.加100

19、μlPCR-A液,混勻,轉(zhuǎn)入純化柱內(nèi),室溫靜置10min,12000rpm離心2min。2.棄收集管內(nèi)液體,加700μlwashing buffer,12000rpm離心2min。3.棄收集管內(nèi)液體,加400μlwashing buffer,12000rpm離心2min。4.棄收集管內(nèi)液體,12000rpm離心2min。5.柱內(nèi)加30μl70°C預(yù)熱洗脫液,12000rpm離心2min。,測序反應(yīng)(以K-ras為例),

20、反應(yīng)體系為:BigDye(2.5X) 0.8μl BigDyeSeqBuffer (5X) 1.6 μl Primer 0.3μlPCR純化產(chǎn)物

21、 1μlddH2O 6.3μlTotal 10μl,,測序產(chǎn)物純化,1.每管加1μlEDTA(125mM);1μlNaAc(3M)到管里。2.每管加10

22、0μl100%酒精,震蕩混勻,室溫靜置15min。3.10°C;4000rpm離心30min,馬上倒置,1200rpm離心1min。4.每管加100μl70%酒精,5°C;4000rpm離心30min,馬上倒置,1200rpm離心1min。5.37°C;30min揮發(fā)凈酒精,加10μl Hi-Di溶解DNA。6.95°C;變性5min,4°C;4min,加樣上機(jī)。,片段分析操作,

23、步驟,1多重?zé)晒釶CR:15μlPCRmix+五種(胃腸)或七種(尿)引物0.8μl(其中D17S283加1.2μl)+1μlDNA.條件:95 °C15min,94 °C1min,56 °C1min,72 °C1min,30個(gè)cycle.2μlPCR產(chǎn)物+0.4μlLIZ size standard+8μl HiDi,95 °C 5min, 4°C冰冷5min。上機(jī),分析

24、數(shù)據(jù)。,Q-PCR操作,詳細(xì)步驟,1.RT反應(yīng):gDNA1μl+RNA 6μl;上機(jī)42°C,2min;離心。RT Buffer 2μl,RT酶0.5μl,Primer 0.5μl;上機(jī)A64程序。2.Q-PCR儀擴(kuò)增 (反應(yīng)體系)2×SYBR 2.5μl Primer 1(

25、5uM) 0.5μlPrimer 2(5uM) 0.5μlRT產(chǎn)物 1 μlNuclease-free water 1μl

26、 Total 5μl,,7900PCR儀反應(yīng)程序,95°C 10min;95°C 15s;60°C 1min,40cycle。RQ Manager 1.2軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。,第五章 結(jié)果解讀及診斷報(bào)告出具,基因測序結(jié)果分析RNA表達(dá)量結(jié)果分析,測序結(jié)果圖及分析,ABI

27、3100測序儀測序,SeqScape v2.0分析結(jié)果為。以K-ras和EGFR為例,K-RAS 基因測序突變類型,K-ras :K2第12(GGT),13密碼子(GGC) K3第61(CAA)密碼子共9種突變類型:,GGT---GAT G12DGGT---GTT G12VGGC---GAC G13DGGT---TGT G12CGGT---GCT G12AGGT-

28、--AGT G12SGGT---CGT G12R,GGC---TGC G13CGGC---GCC G13AGGC---GTC G13V,,,7種 98%,3種 2%,,,EGFR基因測序突變類型:,EGFR 第18, 19 ,20, 21外顯子和第一內(nèi)含子(CA)EGFR 19:容易發(fā)生缺失 EGFR 21:L858R EGFR(CA):(CA)n≤16,EGFR非突變NSCLC患者服

29、用TKI類藥物具有短期療效 EGFR 20:T790M 突變會使患者對EGFR-TKI 類藥物產(chǎn)生耐藥,EGFR18測序圖,EGFR19測序圖,EGFR20測序圖,EGFR21測序圖,EGFR intron 1測序圖,,RNA表達(dá)量結(jié)果圖及分析,使用儀器為:ABI7900熒光定量PCR儀,分析軟件為:RQ Manager 1.2,ERCC1,血液,石蠟組織,,BRCA1,血液,石蠟組織,,,RRm1,血液,石蠟組織,,,VEGF,血

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論