環(huán)鳥苷酸(cGMP)免單抗的制備及競爭ELISA測定方法的建立.pdf

1、環(huán)鳥苷酸(Guanosine3'，5'-cyclic monophosphate，cGMP)和環(huán)腺苷酸(Adenosine3'，5'-cyclic monophosphate，cAMP)是細胞內(nèi)的第二信使，是原核生物和真核生物中重要的信號通路分子。cGMP對細胞內(nèi)多種代謝途徑產(chǎn)生影響。cGMP可以降低心肌代謝，收縮力和功能，參與干細胞的增殖與分化，抑制糖異生以及興奮副交感神經(jīng)。cGMP對視覺信號傳導(dǎo)、平滑肌和骨骼肌、神經(jīng)系統(tǒng)功能、血小板

2、活化、骨生長等的調(diào)節(jié)起到非常重要的作用。
　　20世紀(jì)70-80年代，競爭性蛋白質(zhì)結(jié)合分析法和放射性免疫分析法是檢測cGMP的主要方式。但由于放射性免疫分析法對人體有潛在危害，目前已逐步被以兔多抗或鼠單克隆抗體為關(guān)鍵試劑的酶標(biāo)記法和熒光ELISA法取代。多克隆抗體制備的ELISA試劑盒具有批次間差異大和特異性差的問題，鼠單克隆抗體制備的ELISA試劑盒無上述缺點，但不同cGMP濃度間的吸光度值相差非常小，使用者難以得到可重復(fù)性的檢

3、測數(shù)據(jù)。
　　本研究采用SMCC等偶聯(lián)劑將cGMP偶聯(lián)于載體匙孔血藍蛋白(KLH)，形成結(jié)合抗原cGMP-KLH。通過ELISA方法進行偶聯(lián)鑒定，確認cGMP已經(jīng)連接到載體蛋白上。用cGMP-KLH作為免疫原免疫新西蘭白兔。將兔子脾細胞與240E骨髓瘤樣細胞株融合，得到能夠分泌cGMP抗體的雜交瘤細胞株。通過間接ELISA和間接競爭ELISA方法，選取特異性最好的克隆進行亞克隆并擴大培養(yǎng)，收集上清并采用ProteinA親和柱純化。

4、
　　采用OD280以及fortebio兩種方法測定純化后的兔單抗IgG濃度。分別采用直接ELISA和競爭ELISA法測定抗cGMP兔單抗的效價和特異性。通過檢測抗cGMP兔單抗與載體蛋白(BSA、KLH)的反應(yīng)，顯示cGMP兔單抗不識別載體蛋白。所制備的cGMP兔單抗的效價為3.1 ng/mL，50％抑制濃度(IC50)為12.57ng/mL。檢測抗cGMP兔單抗與cAMP、環(huán)磷酸肌苷(cIMP)、環(huán)單磷酸胞苷(cCMP)、單磷

5、酸腺苷(AMP)、腺苷-5'-二磷酸(ADP)、5'-三磷酸腺苷(ATP)、鳥苷-5'-單磷酸(GMP)、5'-鳥苷二磷酸(GDP)、5'-三磷酸鳥苷(GTP)的交叉反應(yīng)性，根據(jù)交叉反應(yīng)率(Cross reaction，CR)判定cGMP兔單抗對cIMP有33.1％交叉反應(yīng)性，與其他結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)率均小于1.2％。說明cGMP兔單抗具有很高的特異性。
　　對相關(guān)條件進行優(yōu)化，得到競爭ELISA最佳反應(yīng)條件為:cGMP兔單抗最佳