5-羥色胺1A受體激動劑高通量篩選模型的建立以及FABP4蛋白的結(jié)晶.pdf

1、第一部分5-羥色胺1A受體激動劑高通量篩選模型的建立
　　 抑郁癥目前已成為世界第四大疾患，臨床表現(xiàn)為情緒低落、悲觀、睡眠障礙，嚴重者有自傷和自殺沖動。中樞去甲腎上腺素、5-羥色胺、多巴胺等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量過低及其受體功能低下等都被認為是引起抑郁癥的原因。目前，由于生活壓力日益增大以及一些家族基因遺傳，抑郁癥患者數(shù)量逐漸增多，這使得抑郁癥成為全球公共健康中的一大主要問題。
　　 5-HT1A受體是5-HT受體家族中第一

2、個被克隆出來的亞型。人類遺傳學和圖像學研究表明5-HT1A受體與焦慮癥、抑郁癥、精神分裂癥等一系列精神疾病有關(guān)，目前臨床研究表明，其激動劑能有效改善抑郁癥和焦慮癥。因此，開發(fā)和尋找5-HT1A受體的激動劑具有重要意義，而構(gòu)建穩(wěn)定表達人源5-HT1A受體是該受體激動劑篩選的重要方法和手段。
　　 本文中為了尋找5-羥色胺1A(5-HT1A)受體的激動劑，通過報告基因活性檢測的方法建立高通量篩選(HTS)細胞模型。首先將帶有人源5-

3、HT1A受體的真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(pcDNA3.1-h5-HT1AR)與帶有報告基因pCRE-1uc的pcDNA3.1質(zhì)粒(pcDNA3.1-pCRE-1uc)共轉(zhuǎn)染到工具細胞中，通過對工具細胞的選擇、共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的比例、化合物孵育時間及陽性化合物的選擇等條件進行探索和優(yōu)化，建立了一個可以穩(wěn)定表達人源5-HT1A受體并可用于該受體激動劑篩選的細胞模型(HEK293-h5-HT1AR)。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):根據(jù)瞬轉(zhuǎn)實驗中信號值的高低，采

4、用HEK293細胞作為工具細胞;根據(jù)瞬轉(zhuǎn)實驗中的信噪比，實驗發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-h5-HT1AR∶pcDNA3.1-pCRE-1uc的最佳比例為1:3;對化合物孵育時間進行優(yōu)化，選擇的最佳孵育時間為6小時;陽性化合物的選擇過程中，實驗研究了5-HT.HCl，F(xiàn)libanserin，8-OH-DPAT以及Lorcaserin(APD356)四個已報道有5-HT1A受體激動活性的化合物，最后結(jié)果表明APD356在該體系中最適合作為陽性化合

5、物。基于以上條件，構(gòu)建穩(wěn)定表達5-HT1A受體的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，并對該細胞株進行12代的不定期檢測，信號基本維持穩(wěn)定。利用該模型，篩選了實驗室的化合物，篩選到1個化合物，初步推測該化合物可能是5-HT1A受體的激動劑。因此本實驗所建立的模型可用于高通量5-HT1A激動劑的篩選，對于抗抑郁藥的發(fā)現(xiàn)具有一定研究價值。
　　 第二部分脂肪細胞型脂肪酸結(jié)合蛋白的結(jié)晶
　　 脂肪細胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP4/AP2)是第一個被發(fā)現(xiàn)

6、的脂肪酸結(jié)合蛋白，分布廣泛，在脂肪細胞和巨噬細胞中表達較高。該基因的缺陷可以改善胰島素抵抗，并且可以抑制動脈粥樣硬化以及炎癥的發(fā)生，因此，F(xiàn)ABP4已成為治療糖尿病以及粥樣硬化的重要靶標?；谝陨涎芯績r值，研究人員積極尋找FABP4的新型小分子抑制劑。本實驗室在體外篩選到系列FABP4靶標抑制活性較高的化合物，希望進一步了解其蛋白及小分子化合物的結(jié)合模式便于化合物的改造。本項研究主要借助大腸桿菌表達體系大量表達FABP4蛋白，并對該蛋白