優(yōu)化巴馬香豬超排和利用CRISPR-Cas9技術建立PDX-1基因敲除豬的研究.pdf

1、小型豬作為模式動物由來已久，相比小鼠等模式生物，小型豬模型體重與人類相當，器官大小也與人類器官相似，而且在生理生化、解剖學和疾病發(fā)生機理等方面都與人類極為相似，許多基因在嚙齒類動物模型中不具備與人體類似的生理代謝相關功能，而豬相比嚙齒類模型更貼近于人，通過在豬上研究相關基因的功能可以更好的驗證其功能。這些優(yōu)勢都使小型豬模型動物比之其他動物模型不論生物或是醫(yī)學研究領域中都具有極為重要的科研和應用價值。在CRISPR/Cas系統(tǒng)出現(xiàn)之前，沒

2、有合適的胚胎干細胞系一直是限制小型豬基因敲除的主要因素，CRISPR/Cas9技術的出現(xiàn)從技術上打破了這一僵局極大的方便了豬基因敲除模型的建立。
　　PDX-1基因在胰腺發(fā)育中起著重要作用，早期胚胎發(fā)育時期，胰腺的發(fā)育主要是通過背腹兩側的上皮芽進行融合從而形成胰芽。在小鼠中生產PDX-1基因敲除純合子小鼠后發(fā)現(xiàn)，純合敲除的小鼠缺乏成熟的胰腺組織，并且十二指腸的部分區(qū)域也呈現(xiàn)異常狀態(tài)。出生后的小鼠不能存活很久，會很快死于高血糖。巴馬

3、香豬上PDX-1基因在豬并沒有做過敲除研究，尚不清楚其在豬上的功能。
　　本論文主要研究在小型豬上如何通過超數排卵獲得大量優(yōu)質胚胎用于胞漿注射，從而使用CRISPR/Cas9技術得到PDX-1基因敲除的動物模型。在小型豬上獲得胚胎的傳統(tǒng)途徑主要是通過體外IVF、NT、ICSI和孤雌等手段，但由于豬體外培養(yǎng)體系的不完善，導致這些手段共同的缺陷是獲得的胚胎發(fā)育能力較差，囊胚細胞數較小。而通過超數排卵獲得的體內胚胎可以極大程度避免體外培

4、養(yǎng)對胚胎發(fā)育造成影響，從而提供大量優(yōu)質胚胎用于胞漿注射，建立快速穩(wěn)定的生產基因敲除豬模型動物的實驗平臺。
　　綜合實驗結果發(fā)現(xiàn):(1)巴馬香豬的最佳超排程序方案是:在發(fā)情第15天早上9:00按11 IU/kg頸后肌肉注射氯前列烯醇(PG-CL)，間隔8h后再次注射PG-CL，隔天9:00注射21 IU/kg的孕馬血清促性腺激素(PMSG)。間隔72h后按16.7 IU/kg注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)，注射hCG24h后進行查