神經(jīng)肽FF在糖尿病角膜病變中的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　糖尿病角膜病變廣泛存在于糖尿病患者中，危害較大且至今仍缺乏理想的防治措施，目前認(rèn)為角膜的神經(jīng)病變使其感覺、營(yíng)養(yǎng)和代謝功能障礙，是引起角膜病反復(fù)發(fā)作、難治療的根本原因。通過(guò)PCR array技術(shù)對(duì)2型糖尿病模型BKS.Cg-m+/+Leprdb/J小鼠（簡(jiǎn)稱BKS-db/db小鼠）三叉神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其受體的差異基因篩選，我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肽FF(Neuropeptide FF，NPFF)表達(dá)顯著下調(diào)。本研究旨在進(jìn)一步研

2、究NPFF在BKS-db/db小鼠角膜和三叉神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)及定位情況，并探討NPFF在糖尿病角膜病變中的作用及相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法:
　　1、體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　本研究體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用24w齡BKS-db/db小鼠及其對(duì)照db/+小鼠各40只，通過(guò)角膜知覺檢測(cè)、淚液分泌實(shí)驗(yàn)以及β-tublin角膜神經(jīng)染色客觀評(píng)價(jià)糖尿病角膜病變的發(fā)生情況。通過(guò)神經(jīng)逆行示蹤方法，結(jié)膜下注射熒光金標(biāo)記三叉神經(jīng)節(jié)眼支來(lái)源的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，采用免

3、疫組化和熒光技術(shù)顯示NPFF及其受體在BKS-db/db小鼠及其對(duì)照鼠三叉神經(jīng)節(jié)的細(xì)胞定位及表達(dá)，并通過(guò)ELISA檢測(cè)NPFF蛋白在角膜和三叉神經(jīng)節(jié)的表達(dá)情況。在已建立好的BKS-db/db小鼠角膜上皮刮除模型上，結(jié)膜下注射NPFF或者空白對(duì)照藥物PBS，通過(guò)熒光素鈉染色動(dòng)態(tài)觀察角膜上皮愈合的情況，通過(guò)角膜知覺、以及角膜神經(jīng)染色評(píng)價(jià)角膜末梢神經(jīng)修復(fù)情況。
　　2、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　體外培養(yǎng)小鼠角膜緣干細(xì)胞系TKE2以及原代培

4、養(yǎng)小鼠三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)組:表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal Growth Factor，EGF)陽(yáng)性對(duì)照組、甘露醇滲透壓對(duì)照、高糖培養(yǎng)、高糖聯(lián)合10μmol/L濃度NPFF、高糖聯(lián)合100μmol/L濃度NPFF、PBS培養(yǎng)組。通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NPFF對(duì)TKE2細(xì)胞遷移和增殖能力的影響，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR、western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AKT、ERK1/2等信號(hào)通路基因和蛋白的表達(dá)。通過(guò)Live/Dead試劑盒檢測(cè)NP

5、FF對(duì)體外培養(yǎng)的三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)及存活情況的影響。
　　結(jié)果:
　　通過(guò)血糖及體重等一般生長(zhǎng)指標(biāo)監(jiān)測(cè)，以及角膜知覺檢測(cè)和神經(jīng)染色，24w齡BKS-db/db小鼠均出現(xiàn)糖尿病角膜病變的典型特征:淚液分泌異常、角膜知覺減退和末梢神經(jīng)異常等。通過(guò)熒光金逆行示蹤，成功標(biāo)記三叉神經(jīng)節(jié)中眼支來(lái)源的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，并在胞體中檢測(cè)到NPFF及其受體的表達(dá)。免疫熒光、免疫組化、RT-PCR及ELISA檢測(cè)顯示，與db/+對(duì)照小鼠比較，NPFF在

6、BKS-db/db小鼠中表達(dá)顯著下降。與PBS對(duì)照組相比，結(jié)膜下注射NPFF可以顯著促進(jìn)BKS-db/db小鼠角膜上皮損傷后的愈合，并可以促進(jìn)角膜末梢神經(jīng)的修復(fù)及其功能恢復(fù)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)NPFF能夠顯著促進(jìn)高糖環(huán)境下TKE2細(xì)胞的遷移和增殖，Live/Dead檢測(cè)顯示NPFF還能明顯延長(zhǎng)體外培養(yǎng)的三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活時(shí)間;western blot初步證實(shí)NPFF可以在處理5min后特異性激活ERK1/2信號(hào)通路，該信號(hào)通路與細(xì)胞增殖

7、和生長(zhǎng)有關(guān)，而對(duì)AKT信號(hào)通路沒(méi)有明顯影響。
　　結(jié)論:
　　24w齡BKS-db/db小鼠出現(xiàn)典型糖尿病角膜病變的特征，可以作為研究2型糖尿病角膜病變的動(dòng)物模型。NPFF在2型糖尿病模型BKS-db/db小鼠角膜和三叉神經(jīng)節(jié)中表達(dá)顯著下降，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明NPFF具有促進(jìn)角膜末梢神經(jīng)損傷修復(fù)和功能恢復(fù)以及延長(zhǎng)三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞體外存活時(shí)間的作用，NPFF可能是一種潛在的神經(jīng)保護(hù)因子，為糖尿病角膜病變的防治提供了新的研究思路，