遺傳性血管性血友病的實驗診斷和分子發(fā)病機(jī)制研究.pdf

1、血管性血友病因子(von Willebrand Factor，vWF)是血管內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓巨核細(xì)胞合成的一種糖蛋白。vWF質(zhì)的缺陷和量的缺乏會導(dǎo)致血管性血友病(Von Willebrafld disease，vWD)。遺傳性vWD分為三種類型：1型(vWF量的部分缺乏)、2型(vWF質(zhì)的缺陷，又分為2A、2B、2M和2N四個亞型)和3型(vWF量的完全缺乏)，這三種類型和各亞型間具有不同的生理病理機(jī)制。因此臨床實驗室都需要進(jìn)行系列檢測以

2、確保準(zhǔn)確診斷和分型。然而研究該病的分子發(fā)病機(jī)制，有助于了解vWF蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，對攜帶者判定、產(chǎn)前診斷以及患者的預(yù)后、治療都有重要的意義。本研究在血小板計數(shù)(PLT)、出血時間(BT)、部分凝血活酶時問(APTT)、因子FVIIl活性測定(FVIII：C)、瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集試驗(RlPA)、瑞斯托霉素輔因子活性測定(vWF：RCo)等實驗基礎(chǔ)上，建立vWF抗原定量(vWF：Ag)、vWF膠原結(jié)合試驗(vWF：CB)、因子

3、FVIIl結(jié)合實驗(vWF：FVIIlB)和多聚體分析等方法，并采用這些方法對7個遺傳性vWD家系及其家系成員進(jìn)行測定。同時，我們建立了分別以血漿和短肽一vWF73為底物的ADAMTS-13測定方法。按照循證檢驗醫(yī)學(xué)(Evidence Based Laboratory Medicine，EBLM)的原則和臨床實踐情況，我們采用PLT、BT和APTT作為vWD的篩查實驗；FVIlI：C、vWF:Ag和vWF:RCo作為確診實驗；RIPA、

4、vWF:CB和多聚體分析作為分型實驗。按照上述檢測的結(jié)果，本研究明確診斷1型1例、2A型2例、2B型1例、2M型1例和3型2例，其中1型、2M型和2B型vWD為國內(nèi)首次報道。本研究所建立的檢測方法和所采用的優(yōu)化組合適合于絕大多數(shù)vWD患者的診斷和分型需要。 用常規(guī)PCR和半巢式PCR分別擴(kuò)增vWD患者及其家系成員的vWF基因，并進(jìn)行測序分析。結(jié)果鑒定到10個基因突變，其中，5310del 11、2040．2A>G、7289T>

5、A(C2327S)、外顯子6—16大片斷缺失、1203insG和4678C>A(Y1456X)為國際首次報道442OC>A(R1374S)、4827C>T(S1506L)、4232C>T(R1308c),4253C>T(R315c)為國內(nèi)首次報道。為研究基因突變的生物學(xué)意義，我們采用定點突變方法構(gòu)建了R1 308C、R1 374S和C2327S三個突變的表達(dá)載體。體外表達(dá)研究表明，R1 374S引起細(xì)胞分泌下降是其導(dǎo)致本研究1型VWD患

6、者發(fā)病的分子機(jī)制；R1308C不會導(dǎo)致細(xì)胞分泌異常，但突變蛋白功能(膠原結(jié)合活性)降低，其合并5310del引起的VWF合成減少，是導(dǎo)致本研究2B型VWD患者發(fā)病的分子機(jī)制；C2327S導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)異常，影響多聚體形成，并通過顯性抑制效應(yīng)引起細(xì)胞分泌下降和蛋白降解；2040-2A>G突變導(dǎo)致mRNA異常剪接，出現(xiàn)外顯子14和15連續(xù)缺失異常轉(zhuǎn)錄物，導(dǎo)致合成下降。首次對3型vWD大片斷缺失分子發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究，表明Alu序列介導(dǎo)，多種