在非多重耐藥陰溝腸桿菌ST84型臨床分離株中發(fā)現(xiàn)blaNDM-1.pdf

1、目的：
　　研究blaNDM-1在陰溝腸桿菌臨床分離株中對碳青霉烯類藥物耐藥中的作用。
　　方法：
　　1.對患者資料進行收集和整理以及對碳青霉烯類耐藥或敏感性下降的陰溝腸桿菌的篩選:對2012年7月至2013年6月分離自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的共102株陰溝腸桿菌，根據(jù)菌落形態(tài)和革蘭染色進行初步的鑒定，再采用Vitek-2全自動微生物分析儀嚴格按照廠家說明書進行菌種鑒定和藥敏試驗;采用E-test法對耐藥表型進行進

2、一步的測定。
　　2.對臨床分離的對碳青霉烯類耐藥或敏感性下降的陰溝腸桿菌耐藥基因型進行檢測:采用煮沸法提取細菌總DNA，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來檢測這部分對碳青霉烯類耐藥或敏感性下降的陰溝腸桿菌是否攜帶blaNDM-1，對攜帶blaNDM-1的陰溝腸桿菌再依次采用CLSI推薦的雙紙片法來確定超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的表型，三維試驗來進行AmpC酶的表型檢測，改良Hodge試驗來進行碳青霉烯酶的表型測定，雙紙片EDTA協(xié)

3、同法來進行金屬酶的表型檢測以及PCR方法來測定是否攜帶其它的耐藥基因，測定的耐藥基因包括其它碳青霉烯酶基因、超廣譜β內(nèi)酰胺酶基因、質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶基因、質(zhì)粒介導(dǎo)16S rRNA甲基化酶基因和質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因，同時對PCR陽性擴增產(chǎn)物進行DNA測序，所有的DNA序列均利用NCBI的Blast進行比對來確定基因型。
　　3.耐藥基因的轉(zhuǎn)移:以大腸埃希菌EC600作為受體菌，以攜帶NDM-1基因的陰溝腸桿菌為供體菌進行接合

4、試驗，對疑似成功接合的接合子用全自動微生物分析儀Vitek-2進行菌種鑒定，并用PCR和DNA測序測定接合子的耐藥基因。使用QIAGEN(Hilden，Germany)質(zhì)粒中量提取試劑盒來提取轉(zhuǎn)化接合子的質(zhì)粒DNA，通過電泳來對臨床分離菌株和接合子的質(zhì)粒大小進行測量。
　　4.MLST序列型的分析:根據(jù)陰溝腸桿菌的7個管家基因來對菌株的序列型進行分析。
　　結(jié)果：
　　1.本研究分離到一株攜帶NDM-1基因的陰溝腸桿菌

5、，該菌株分離自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科1例重度顱腦損傷伴嚴重吸入性肺炎患者的痰液標本，該患者于2013年3月12日被收治入院，入院后第11天開始出現(xiàn)低熱，做痰培養(yǎng)分離出陰溝腸桿菌，被命名為陰溝腸桿菌WZ56。該陰溝腸桿菌WZ56采用E-test法測定MIC值，參照CLSI標準，除了對氨曲南敏感外，對其他β-內(nèi)酰胺類抗生素均表現(xiàn)為耐藥，對左氧氟沙星、慶大霉素、阿米卡星、磷霉素、復(fù)方新諾明、多粘菌素E和替加環(huán)素均表現(xiàn)為敏感。

6、　　2.陰溝腸桿菌WZ56在確定MBLs的雙紙片EDTA協(xié)同試驗為陽性，ESBLs確定試驗為陰性，頭孢西丁三維試驗為陰性，改良Hodge試驗為陰性。通過PCR檢測和DNA測序發(fā)現(xiàn)陰溝腸桿菌WZ56攜帶blaNDM-1、blaCTX-M-9和qnrA1。接合菌的質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR擴增blaNDM-1、blaCTX-M和qnrA1基因，只有blaNDM-1為陽性，未檢測到blaCTX-M和qnrA1，表明blaNDM-1為質(zhì)粒介導(dǎo)，且bl