Id3調(diào)控抗GBM腎炎早期Th17和Treg細(xì)胞分化的機(jī)制研究.pdf

1、目的：新月體腎炎(Crescentic glomerulonephritis CGN)起病急驟，腎功能急劇惡化，預(yù)后差。其中抗腎小球基底膜（GBM）型腎小球腎炎（抗GBM腎炎）是最嚴(yán)重的一種，其主要是由抗GBM抗體介導(dǎo)的能夠引起彌漫性腎小球受損的一種自身免疫性疾病，早期以Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥免疫反應(yīng)為主。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）則通過(guò)抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答減輕病理?yè)p害。DNA結(jié)合抑制因子3(Id3)可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)Th17和Treg細(xì)胞重

2、要轉(zhuǎn)錄因子(Rorγt和Foxp3)的表達(dá)。在抗GBM腎炎早期，通過(guò)對(duì)Id3調(diào)節(jié) Th17和Treg分化機(jī)制的研究，有助于探討免疫反應(yīng)活化的關(guān)鍵因素，為早期干預(yù)免疫反應(yīng)，減輕病理?yè)p害提供理論依據(jù)。
　　方法：1.建立小鼠抗GBM腎炎模型[1]，在不同的時(shí)間點(diǎn)將小鼠處死后收集并檢測(cè)血清中的肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）含量，隨機(jī)尿中尿蛋白/肌酐比值（ACR）變化；留取腎臟標(biāo)本檢測(cè)病理改變；流式細(xì)胞檢測(cè)術(shù)(FACS)檢測(cè)脾臟中Th1

3、7和Treg細(xì)胞表達(dá)情況；ELISA的方法檢測(cè)IL-17A和TGF-?1含量；Western blot檢測(cè)腎臟、脾臟組織中Id3/E2a/Foxp3/Rorγt等的蛋白表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)腎臟、脾臟組織中Id3/E2a/Foxp3/Rorγt等的mRNA的表達(dá)；免疫共沉淀（Co-ip）檢測(cè)腎臟和脾臟中Id3和E2a的結(jié)合情況。2.體外獲得未分化CD4+T細(xì)胞，促進(jìn)其增殖并活化后分別誘導(dǎo)其向Th17和Treg細(xì)胞進(jìn)行定向分化，培養(yǎng)6天。

4、通過(guò)FACS、ELISA、Western blot和RT-PCR分別檢測(cè)其相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)。3.用Id3 siRNA沉默naive CD4+T細(xì)胞后誘導(dǎo)向Th17和Treg細(xì)胞分化。RT-PCR和ELISA檢測(cè)Foxp3/Rorγt和IL-17A/TGF-?1/IL-10含量。
　　結(jié)果：1.成功建立抗GBM腎炎模型：與正常組小鼠相比，腎炎組小鼠腎臟病理示GBM不規(guī)則彌漫增厚甚至部分?jǐn)嗔选⑾的ぜ?xì)胞和基質(zhì)增生、新月體形成；免疫熒光示鼠

5、IgG和兔IgG在基底膜呈線性沉積；Scr、BUN和ACR增加明顯。2.抗GBM腎炎模型組中細(xì)胞、基因和蛋白三個(gè)水平檢測(cè)到的相關(guān)因子均呈規(guī)律性表達(dá)：FACS示Th17細(xì)胞比例先增加后下降，Treg細(xì)胞一直處于上升趨勢(shì)；血清中TGF-?1和IL-17的變化趨勢(shì)不明顯；無(wú)論從基因還是蛋白水平Id3的表達(dá)均與Th17和Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子水平相關(guān)，且隨著腎炎的進(jìn)展Id3與E2a的結(jié)合力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。體外實(shí)驗(yàn)顯示：在誘導(dǎo)分化后的