抗病毒先天性免疫通過調控肺上皮干-祖細胞表達及損傷-修復反應介導COPD氣道重建和肺泡稀薄化.pdf

1、第一部分、肺上皮干/祖細胞的篩選和鑒定
　　 目的：分離、篩選和鑒定肺上皮干/祖細胞，分析其與肺上皮修復反應的關系。
　　 方法：首先從小鼠肺組織中獲取單個肺細胞懸液，通過流式細胞術檢測CD45-/CD31-/Sca-1+(Stem Cell Antigen-1)細胞在正常小鼠肺內的表達水平及其細胞周期，并采用流式細胞分選術從肺單細胞懸液中篩選出該細胞群，使用免疫熒光染色對其具體細胞成分進行鑒別，體外培養(yǎng)評估其增殖能力，

2、最后通過病毒病原相關分子模式(Pathogen-Associated Molecular Patterns，PAMP)感染模型明確該細胞群與肺上皮修復反應的關系。
　　 結果：正常小鼠肺內有低水平的CD45-/CD31-/Sca-1+細胞表達。與CD45-/CD31-/Sca-1-細胞相比，CD45-/CD31-/Sca-1+細胞主要處于DNA合成期或合成后期/分裂期，且在體外培養(yǎng)過程中僅CD45-/CD31-/Sca-1+細胞

3、分裂增殖形成細胞集落；細胞免疫熒光染色顯示CD45-/CD31-/Sca-1+細胞主要由細支氣管肺泡干細胞、肺泡Ⅱ型上皮細胞和Clara細胞組成。這些體外實驗結果表明具有增殖能力的CD45-/CD31-/Sca-1+細胞是一個異質干/祖細胞群。之后體內實驗的結果發(fā)現(xiàn)在病毒雙鏈RNA(dsRNA)模擬物Poly(I：C)誘導肺上皮細胞凋亡的同時，肺CD45-/CD31-/Sca-1+細胞的表達水平出現(xiàn)上升，并隨著凋亡程度的加重而逐漸升高；

4、且在此過程中，CD45-/CD31-/Sca-1+細胞表達水平的變化與肺上皮Ki67陽性細胞所呈現(xiàn)的動力學十分相似。由此可知Poly(I：C)刺激同時觸發(fā)了肺上皮的損傷和修復反應，且肺CD45-/CD31-/Sca-1+細胞參與了肺上皮的再生修復過程。
　　 結論：肺CD45-/CD31-/Sca-1+細胞是具有部分祖細胞特性的異質干/祖細胞群，該細胞群的表達水平代表了Poly(I：C)刺激下肺上皮組織的再生修復反應。
　

5、　 第二部分、香煙煙霧和病毒PAMP聯(lián)合誘導的COPD小鼠模型中肺上皮干/祖細胞表達和損傷/修復失衡
　　 目的：觀察COPD(Chronic Obstructive Pulmonary Disease)肺組織中上皮干/祖細胞的表達及不同解剖區(qū)域上皮的損傷/修復反應。
　　 方法：通過香煙煙霧(Cigarette Smoke，CS)和病毒PAMP模擬物Poly(I：C)聯(lián)合暴露建立肺損傷模型，檢測該模型肺組織中氣道和肺

6、泡的病理改變，采用流式細胞術檢測肺CD45-/CD31-/Sca-1+上皮干/祖細胞群在COPD肺組織中的表達水平，通過TUNEL和Ki67等免疫熒光染色分別觀察氣道和肺泡上皮細胞的凋亡和增殖情況。
　　 結果：香煙煙霧和Poly(I：C)聯(lián)合暴露的小鼠肺組織中出現(xiàn)顯著氣道壁增厚和肺泡結構破壞，是成功模擬了氣道纖維化重建和肺泡稀薄化的COPD模型；在該COPD模型中，肺CD45-/CD31-/Sca-1+上皮干/祖細胞表達上調，

7、但與Poly(I：C)組比較其表達水平明顯下降，表明香煙煙霧抑制了Poly(I：C)誘導的肺上皮干/祖細胞擴增；TUNEL染色和免疫熒光染色顯示模型中氣道上皮細胞以增殖反應為主，而肺泡上皮細胞以凋亡反應為主。
　　 結論：香煙煙霧和病毒PAMP模擬物Poly(I：C)聯(lián)合暴露誘導的小鼠肺損傷模型是同時模擬了COPD小氣道纖維化重建和肺泡稀薄化的COPD模型；香煙煙霧抑制了Poly(I：C)誘導的肺CD45-/CD31-/Sca-

8、1+上皮干/祖細胞擴增，提示香煙煙霧和Poly(I：C)聯(lián)合暴露刺激通過影響肺上皮干/祖細胞的表達導致異常的肺上皮修復反應；在該COPD模型中氣道和肺泡上皮呈現(xiàn)相反的上皮細胞損傷/修復失衡：氣道上皮以增殖反應為主，而肺泡上皮則以凋亡反應為主，與觀察到的氣道纖維化重建和肺泡稀薄化改變一致，提示肺上皮損傷/修復失衡參與COPD肺組織重建。
　　 第三部分、抗病毒先天性免疫對COPD中肺上皮干/祖細胞和損傷/修復反應的影響
　　

9、 目的：檢測抗病毒先天性免疫TLR3(Toll-Like Receptor3)和RLH-MAVS(RIG-Like Helicases-Mitochondrial Antiviral SignalingProtein)信號通路對COPD肺組織中上皮干/祖細胞表達和不同解剖區(qū)域上皮損傷/修復反應的影響。
　　 方法：使用野生型(Wild Type，WT)、TLR3基因敲除(TLR3-/-)及MAVS基因敲除(MAVS-/-)小鼠

10、重復香煙煙霧和Poly(I：C)聯(lián)合暴露誘導的COPD模型，檢測各型小鼠肺組織中氣道和肺泡的病理改變，流式細胞術檢測CD45-/CD31-/Sca-1+肺上皮干/祖細胞的表達水平，并通過TUNEL和Ki67等免疫熒光染色分別觀察氣道和肺泡上皮細胞的凋亡和增殖情況。
　　 結果：香煙煙霧和Poly(I：C)聯(lián)合暴露后，TLR3-/-和MAVS-/-小鼠肺組織中炎性細胞浸潤程度和CD45-/CD31-/Sca-1+細胞表達均較WT小

11、鼠明顯下降，敲除MAVS基因同時逆轉了氣道纖維化重建和肺泡稀薄化，而敲除TLR3基因僅改善了氣道增生和纖維化。TUNEL和免疫熒光染色的結果顯示TLR3和MAVS表達缺失均同時抑制了肺上皮細胞的凋亡和增殖反應，但在CS+P暴露的TLR3-/-小鼠肺組織中，氣道上皮細胞凋亡/增殖水平幾乎持平，肺泡上皮中增殖細胞比例明顯低于凋亡細胞比例；而CS+P暴露的MAVS-/-小鼠氣道和肺泡上皮細胞凋亡/增殖水平均接近同一水平，說明敲除MAVS基因能

12、夠同時逆轉CS+P誘導的氣道上皮過度修復和肺泡上皮的修復不足，而TLR3基因缺失僅抑制了氣道上皮的過度修復。
　　 結論：在香煙煙霧和Poly(I：C)誘導的COPD模型中，TLR3和RLH-MAVS信號通路參與和促進了肺組織炎癥，并通過調控肺CD45-/CD31-/Sca-1+上皮干/祖細胞表達以及上皮細胞凋亡和增殖反應介導肺組織重建，其中，氣道上皮呈現(xiàn)修復過度的損傷/修復失衡主要受到TLR3信號通路的調控，而肺泡上皮表現(xiàn)為修