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文檔簡介
1、本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了重組人ICOS胞外區(qū)的原核表達(dá)載體，進(jìn)行了重組ICOS蛋白的表達(dá)與純化，并將其作為抗原免疫小鼠。根據(jù)GenBank基因庫中ICOS胞外區(qū)基因序列設(shè)計(jì)引物，用RT—PCR法從人T淋巴瘤細(xì)胞Jurkat的總mRNA中擴(kuò)增出ICOS胞外區(qū)單鏈基因，并運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增出ICOS胞外區(qū)雙鏈基因，將ICOS胞外區(qū)雙鏈基因插入到原核表達(dá)載體pET—28a中，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。轉(zhuǎn)化E．coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表
2、達(dá)目的蛋白。通過包涵體變復(fù)性純化目的蛋白，并通過Western blot鑒定目的蛋白。后將目的蛋白作為抗原免疫小鼠。結(jié)果獲得ICOS雙鏈基因大小為757 bp，構(gòu)建的重組表達(dá)載體中目的基因序列完全正確。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS—PAGE分析和Westernblot鑒定表明目的蛋白在E．coli BL21(DE3)中高效表達(dá)，相對(duì)分子質(zhì)量約為31KD，與預(yù)期結(jié)果相符。免疫小鼠后得到較高的抗血清效價(jià)。檢測結(jié)果表明：成功地構(gòu)建人重組ICOS
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