轉(zhuǎn)錄因子Foxo1和天然產(chǎn)物PL-C對NK細(xì)胞發(fā)育與功能的調(diào)控作用及機制研究.pdf

1、NK細(xì)胞是機體天然免疫的關(guān)鍵組分，占外周淋巴細(xì)胞的5～10％。它是機體免疫防御的第一道防線，在早期惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、病毒和胞內(nèi)寄生菌、真菌的清除以及母胎界面的形成中具有關(guān)鍵作用。NK細(xì)胞的這些作用既可通過直接的細(xì)胞毒殺傷作用，也可通過其分泌的細(xì)胞因子如IFN-γ等參與調(diào)控適應(yīng)性免疫而實現(xiàn)。
　　小鼠NK細(xì)胞的發(fā)育主要源自于骨髓的造血干細(xì)胞，經(jīng)共同淋巴祖細(xì)胞向NK祖細(xì)胞分化(precursor NK，pNK，CD122+NK1.1-D

2、X5-)。pNK通過不成熟NK細(xì)胞(immature NK，iNK，CD122+NK1.1+DX5-)向成熟NK細(xì)胞(mature NK， mNK，CD122+NK1.1+DX5+)發(fā)育。當(dāng)小鼠NK細(xì)胞獲得表面標(biāo)志NK1.1分子后，根據(jù)表面受體CD11b和CD27的表達(dá)水平，依次由CD11b-CD27+向CD11b+CD27+而最終形成CD11b+CD27-終末成熟NK細(xì)胞。
　　NK細(xì)胞發(fā)育與功能的正常發(fā)揮依賴于內(nèi)源性、外源性因

3、子;正向、負(fù)向轉(zhuǎn)錄因子的相互平衡。外源性因子主要包括正向的介素-15（IL-15）和負(fù)向的轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)，而內(nèi)源性的轉(zhuǎn)錄因子主要包括調(diào)控NK細(xì)胞早期發(fā)育、促進(jìn)pNK形成的Ikaros，Pu.1，Ets1和維生素D3調(diào)節(jié)蛋白1(VDUP-1);促進(jìn)iNK形成的E4BP4，Id2和MEF;促進(jìn)NK細(xì)胞終末成熟的GATA3、Tbx21、Eomes和Irf2。但是目前這些發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子均為正向調(diào)控NK細(xì)胞發(fā)育與成熟，而對NK細(xì)胞

4、的內(nèi)源性負(fù)性調(diào)控因子的認(rèn)識仍處于初始階段。作為調(diào)控NK細(xì)胞終末成熟關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，Tbx21基因敲除小鼠（Tbx21-/-）終末期CD11b+CD27-NK細(xì)胞亞群幾乎缺失，但其上游信號通路目前知之甚少。
　　基于上述我們提到的NK細(xì)胞發(fā)育與功能調(diào)控研究領(lǐng)域中的兩個關(guān)鍵問題，我們從內(nèi)源性因子-轉(zhuǎn)錄因子Foxo1和外源性因素-天然化合物Phyllanthusmin C(PL-C)兩個方面，深入探討NK細(xì)胞發(fā)育與功能的調(diào)控新機制，并尋

5、找激活NK細(xì)胞IFN-γ分泌的新策略、新分子。
　　方法與結(jié)果:
　　1.Foxo1對NK細(xì)胞發(fā)育與功能的調(diào)控作用及相關(guān)機制研究
　　Foxo1在細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期、凋亡、自噬和抗氧化應(yīng)激等方面具有重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)Foxo1參與造血干細(xì)胞、共同淋巴祖細(xì)胞的生成，以及T、B細(xì)胞的發(fā)育與功能的調(diào)控，且在不同細(xì)胞中對靶基因的調(diào)控作用具有高度的細(xì)胞背景特異性。但是其在NK細(xì)胞中的作用目前尚未見研究報道。我們通過一系列的體

6、內(nèi)、外模型研究發(fā)現(xiàn):
　　(1) Foxo1缺陷減少了NK細(xì)胞向外周淋巴節(jié)的歸巢，其機制可能與CD62L低表達(dá)有關(guān)
　　為了研究Foxo1對NK細(xì)胞發(fā)育與功能的影響，我們首先通過Ncr1iCre小鼠與Foxo1fl/fl小鼠（含有floxed Foxo1等位基因）雜交構(gòu)建了NK細(xì)胞Foxo1特異性敲除(Foxo1△NK)的小鼠模型。Foxo1敲除后對骨髓、脾臟中NK細(xì)胞的比例、數(shù)量無明顯影響，但是顯著降低外周淋巴結(jié)NK細(xì)胞的

7、比例和數(shù)量，且顯著降低淋巴細(xì)胞歸巢關(guān)鍵因子CD62L的表達(dá)。
　　(2) Foxo1以干細(xì)胞內(nèi)源性的方式抑制NK細(xì)胞終末成熟
　　Foxo1△NK小鼠骨髓、脾臟、外周淋巴結(jié)和外周血終末成熟CD11b+CD27-NK細(xì)胞比例明顯增加，CD27表達(dá)降低，且終末成熟CD43+KLRG+NK細(xì)胞比例增加。通過骨髓移植將野生型小鼠或Foxo1△NK小鼠骨髓細(xì)胞移植至CD45.1同背景野生型小鼠中我們發(fā)現(xiàn)Foxo1抑制了NK細(xì)胞成熟的動

8、力學(xué)過程。而通過將野生型小鼠和Foxo1△NK小鼠骨髓細(xì)胞以等比例的方式移植至同一Rag2-/-Il2rg-/-小鼠體內(nèi)構(gòu)建嵌合體小鼠發(fā)現(xiàn)Foxo1以干細(xì)胞內(nèi)源性的方式調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的成熟。
　　(3) Foxo1抑制NK細(xì)胞IFN-γ分泌和腫瘤直接靶向殺傷作用
　　Foxo1△NK小鼠脾臟細(xì)胞在體外被IL-12與IL-18聯(lián)合刺激后分泌IFN-γ的NK細(xì)胞比例無明顯改變，但單個NK細(xì)胞分泌IFN-γ強度明顯增加;人NK細(xì)胞株

9、NKL無論是持續(xù)過表達(dá)、可誘導(dǎo)性表達(dá)或敲低Foxo1均以相同的方式影響IFN-γ的生成。
　　Foxo1敲除顯著升高小鼠NK細(xì)胞對Yac-1的體外直接靶向殺傷作用，而過表達(dá)Foxo1顯著抑制NKL細(xì)胞對靶細(xì)胞K562的直接靶向殺傷作用。體內(nèi)實驗進(jìn)一步證實Foxo1敲除明顯抑制了小鼠B16F10細(xì)胞在體內(nèi)向肺臟轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。
　　2.天然化合物PL-C促進(jìn)人NK細(xì)胞IFN-γ分泌及相關(guān)機制研究
　　為了尋找更多的NK細(xì)胞激

10、活途徑，改善目前臨床上提高體內(nèi)IFN-γ水平的治療策略的毒副作用，本論文通過對近50多種天然化合物單體進(jìn)行篩選，我們發(fā)現(xiàn)了一個源自木酚素植物提取物的小分子化合物Phyllanthusmin C(PL-C)可顯著增加人NK細(xì)胞IFN-γ的分泌。
　　(1) PL-C促進(jìn)人CD56bright和CD56dim NK細(xì)胞IFN-γ轉(zhuǎn)錄和分泌
　　在細(xì)胞因子IL-12、IL-15存在或不存在的情況下，PL-C均可增加健康人外周血外周

11、單個核細(xì)胞(PMBC)、富集NK細(xì)胞中IFN-γ+ NK細(xì)胞比例;通過純化的NK細(xì)胞(≥99.5％）進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在IL-12、IL-15存在或不存在的情況下PL-C均可直接促進(jìn)CD56bright和CD56dim NK細(xì)胞IFN-γ mRNA合成和蛋白分泌，且與IL-12具有協(xié)同效應(yīng)。
　　(2) PL-C對人NK細(xì)胞直接靶向殺傷作用及T細(xì)胞IFN-γ分泌均無明顯影響
　　為進(jìn)一步研究PL-C對NK細(xì)胞殺傷功能的影響，我

12、們采用純化NK細(xì)胞進(jìn)行體外靶細(xì)胞直接殺傷實驗分析。我們發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞在IL-12或IL-15存在的情況下，PL-C對NK細(xì)胞高毒性的靶細(xì)胞K562或低毒性作用的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株ARH-77的直接細(xì)胞殺傷作用均無明顯影響。
　　為了分析PL-C對人NK細(xì)胞IFN-γ分泌是否具有細(xì)胞特異性，我們接下來觀察了在IL-12或IL-15存在的條件下，PL-C對CD4+和CD8+T細(xì)胞的IFN-γ分泌是否有促進(jìn)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PL-C對CD4+

13、和CD8+T IFN-γ+細(xì)胞比例無顯著影響。
　　(3) PL-C通過NF-κB信號通路促進(jìn)NK細(xì)胞IFN-γ分泌
　　為進(jìn)一步研究PL-C促進(jìn)NK細(xì)胞IFN-γ分泌的機制，我們綜合分析了既往報道的參與NK細(xì)胞IFN-γ分泌的主要信號通路。我們發(fā)現(xiàn)在IL-12或IL-15存在的情況下，PL-C對IL-12、IL-15的受體(IL-12Rβ1、IL-12Rβ2、IL-15Rα、IL-15Rβ)及其下游信號通路T-bet、ST

14、AT家族等蛋白均無顯著影響。而不論IL-12、IL-15是否存在，PL-C均可顯著促進(jìn)NF-κB p65的磷酸化，而對p65 mRNA和總蛋白的表達(dá)無明顯影響。且NF-κB特異性抑制劑甲苯磺?；?L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)可顯著抑制PL-C對人原代NK和細(xì)胞株NKL細(xì)胞IFN-γ分泌的促進(jìn)作用。通過凝膠電泳遷移率實驗(EMSA)和染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)PL-C可顯著促進(jìn)p65結(jié)合到IFNG DNA啟動子C3

15、-33PκB位點上。
　　研究結(jié)論:
　　1.Foxo1對NK細(xì)胞發(fā)育與功能的調(diào)控及機制:
　　1) Foxo1缺陷導(dǎo)致CD62L低表達(dá)而損傷NK細(xì)胞向外周淋巴節(jié)的歸巢;
　　2) Foxo1負(fù)向調(diào)控NK細(xì)胞終末成熟而對NK細(xì)胞的早期成熟無明顯影響;
　　3) Foxo1抑制NK細(xì)胞的IFN-γ分泌功能和腫瘤細(xì)胞靶向殺傷作用;
　　4) Foxo1磷酸化介導(dǎo)了促炎因子或腫瘤細(xì)胞激活NK細(xì)胞過程中的Fo

16、xo1轉(zhuǎn)錄活性失活，從而釋放Foxo1對NK細(xì)胞發(fā)育與功能的抑制效應(yīng);
　　5)通過構(gòu)建Foxo1敲除、Tbx21半敲除或者全敲的動物模型，證實Foxo1對NK細(xì)胞的成熟的抑制作用必需通過其對Tbx21的抑制性調(diào)節(jié)而實現(xiàn);
　　6)在人NK細(xì)胞中Foxo1直接結(jié)合TBX21 DNA啟動子區(qū)域forkhead共有序列而在小鼠NK細(xì)胞中Foxo1被Sp1招募到小鼠Tbx21啟動子Sp1的DNA結(jié)合位點而抑制Sp1對Tbx21的轉(zhuǎn)

17、錄起始作用。
　　2.天然化合物PL-C通過TLR-NF-κB通路選擇性促進(jìn)人NK細(xì)胞IFN-γ分泌
　　1) PL-C促進(jìn)人CD56bright和CD56dim NK細(xì)胞IFN-γ轉(zhuǎn)錄和分泌且與IL-12具有協(xié)同效應(yīng)，但不影響NK細(xì)胞殺傷及T細(xì)胞的IFN-γ分泌功能;
　　2) PL-C對IL-12和IL-15的受體及其下游信號通路無明顯作用;
　　3) PL-C通過直接激活TLR-NF-κB信號通路而促進(jìn)NK

18、細(xì)胞IFN-γ分泌。
　　總之，通過上述兩部分實驗，我們發(fā)現(xiàn)了首個負(fù)性調(diào)控NK細(xì)胞終末成熟和功能的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子Foxo1，且證實了其機制主要是通過且必需通過其對NK關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Tbx21表達(dá)的抑制性調(diào)節(jié)而實現(xiàn)，極大的豐富了NK細(xì)胞發(fā)育與功能的負(fù)性調(diào)控網(wǎng)絡(luò);另一方面我們發(fā)現(xiàn)了一個特異性激活NK細(xì)胞INF-γ分泌功能而不影響NK細(xì)胞殺傷功能的天然小分子化合物PL-C，且闡明了其機制是通過其對TLR-NF-κB軸的激動作用而實現(xiàn)的，為