EPA對人肝膽管癌FRH-0201細胞生長的抑制作用及其機制.pdf

1、含有兩個或兩個以上雙鍵的不飽和脂肪酸為多不飽和脂肪酸(PUFA)。國內外實驗發(fā)現(xiàn)PUFA在體外能殺死腫瘤細胞。根據(jù)雙鍵位置的不同，PUFA又可分為ω-3和ω-6兩種不飽和脂肪酸。ω-3多不飽和脂肪酸(ω-3PUFA)是人體必須的營養(yǎng)成分之一，也是參與細胞膜膜磷脂構成和細胞內代謝調控的重要結構脂肪酸。體內外藥理學實驗證實ω-3PUFA能抑制腫瘤的生長、侵襲及轉移，增強某些抗癌藥物的療效，延長荷瘤宿主的生存時間。本課題組也在先前的研究中發(fā)現(xiàn)

2、DHA對人胃癌細胞AGS具有顯著的增殖抑制作用。ω-3PUFA的另一個成員為二十碳五烯酸(EPA)，許多體內外實驗研究表明其對多種腫瘤具有抑制效應。本課題以一株能較好地代表膽管癌原發(fā)灶細胞所有群體的膽管癌細胞FRH-0201為實驗模型，旨在研究EPA體外對該細胞株的增殖抑制作用及其機制。
　　 1、EPA對人肝膽管癌細胞株FRH-0201增殖的影響
　　 MTT法測定結果表明，EPA對FRH-0201細胞作用48小時后，

3、明顯抑制FRH-0201細胞增殖，最高抑制率達89.92±0.42％，IC50值為32.20±1.70μg/ml。各處理組細胞在倒置顯微鏡下觀察形態(tài)改變明顯，細胞開始皺縮，細胞間顆粒增多，死細胞增多。EPA對正常小鼠成纖維細胞L-929無明顯抑制作用，不同濃度組間及對照組OD值相比差異無顯著性(P>0.05)。
　　 臺盼藍拒染細胞數(shù)法測定生長曲線，發(fā)現(xiàn)EPA各濃度在0到96h間對FRH-0201細胞增殖均有抑制作用，并呈時間依

4、賴性。
　　 流式細胞儀檢測分析結果表明，F(xiàn)RH-0201細胞經(jīng)EPA32、50、70μg/ml處理48小時后，其G0/G1期細胞百分比隨著EPA濃度的增加而上升，而S期和G2/M期細胞百分比則顯著下降。細胞阻滯在G0/G1期。
　　 2、EPA體外誘導人肝膽管癌細胞株FRH-0201細胞凋亡的作用
　　 吖啶橙染色后，在熒光顯微鏡下觀察，對照組FRH-0201細胞核DNA顯黃綠色均勻熒光，EPA各處理組細胞核或

5、細胞質內可見致密的黃綠色熒光，甚至可見濃染的黃綠色碎片，呈現(xiàn)典型的細胞凋亡形態(tài)學變化。
　　 透射電鏡觀察FRH-0201細胞的超微結構，發(fā)現(xiàn)經(jīng)EPA40μg/ml處理24h后，胞漿內形成空泡，細胞核染色質發(fā)生邊集固縮，在核膜周邊聚集形成高電子密度的質塊，呈現(xiàn)典型的凋亡細胞形態(tài)改變。
　　 AnnexinV/PI雙染法檢測凋亡細胞，結果顯示，EPA50、70μg/ml作用48小時的細胞凋亡率分別為37.3％和62.2％，

6、明顯高于正常對照組(1.3％)。EPA50、70μg/ml作用48小時的晚期凋亡細胞和壞死細胞比例分別為7.0％和7.5％。
　　 3、EPA體外誘導FRH-0201細胞凋亡機理的初步研究
　　 JC-1染色后，流式細胞儀檢測線粒體跨膜電位(△ψm)的變化，結果顯示，F(xiàn)RH-0201細胞線粒體△ψm下降隨EPA劑量的增大而顯著增多(P<0.05)。
　　 FRH-0201細胞經(jīng)不同濃度EPA作用48小時后，免疫組

7、化法檢測其細胞色素c蛋白表達，蛋白陽性的細胞胞漿內出現(xiàn)棕色顆粒。計算機半定量分析結果顯示，EPA處理組細胞內棕色顆粒的強弱和陽性細胞的比例明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05，p<0.001)。
　　 Westernblot檢測了EPA對FRH-0201細胞caspase-3和caspase-9蛋白表達的影響。結果顯示，與對照組相比，EPA不同濃度處理FRH-0201細胞24h后，caspase-3和caspase-

8、9蛋白表達顯著提高。
　　 4、EPA對FRH-0201細胞株SOD、MDA的影響
　　 全自動生化分析儀檢測FRH-0201細胞內SOD(波長550nm)和MDA(波長532nm)的含量。結果顯示，各濃度EPA均能顯著或極顯著降低細胞的SOD活性(p<0.05；p<0.001)，用各濃度EPA處理后，F(xiàn)RH-0201細胞的MDA含量極顯著上升(p<0.01；p<0.001)。
　　 5、結論
　　 EP