利用CRISPR-Cas9建立Nanog-EGFP小鼠胚胎干細(xì)胞系及在培養(yǎng)液成分篩選中的應(yīng)用.pdf

1、胚胎干細(xì)胞因其具有體外自我更新以及多向分化的能力，成為研究基因功能、細(xì)胞治療和組織再生等的有力工具。近年來，隨著胚胎干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展及臨床研究不斷取得新的突破，胚胎干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的價(jià)值越來越為人們所重視。1981年科學(xué)家們第一次通過飼養(yǎng)層體系實(shí)現(xiàn)了小鼠胚胎干細(xì)胞的分離以及體外培養(yǎng)。胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系經(jīng)歷了一個(gè)漫長(zhǎng)的發(fā)展階段。2008年小鼠胚胎干細(xì)胞的N2B27+2iL培養(yǎng)體系被廣泛應(yīng)用，現(xiàn)已成為大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞的

2、首選。盡管這種培養(yǎng)體系可以使小鼠胚胎干細(xì)胞在體外很好地維持克隆形態(tài)以及多能性狀態(tài)，但N2B27成分復(fù)雜，且成本過高;在不影響培養(yǎng)效果的同時(shí)簡(jiǎn)化培養(yǎng)液成分，使其組分更加明確，相應(yīng)降低培養(yǎng)成本是一個(gè)重要研究方面。
　　隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，使得包括干細(xì)胞在內(nèi)的多個(gè)領(lǐng)域有了突破性的進(jìn)展。從ZFNs到TALENs，再到CRISPR/Cas9;從最初由蛋白進(jìn)行識(shí)別到核酸酶的識(shí)別，基因編輯技術(shù)的發(fā)展日新月異。近年來，CRISPR/Cas9技

3、術(shù)的發(fā)展使得基因編輯研究進(jìn)入了一個(gè)新的時(shí)代。它利用sgRNA對(duì)DNA特定位點(diǎn)的識(shí)別以及Cas9蛋白的DNA酶活性，使DNA雙鏈產(chǎn)生斷裂。DNA雙鏈的斷裂誘導(dǎo)細(xì)胞啟動(dòng)同源重組機(jī)制的基因自我修復(fù)，使得基因敲除和基因重組的效率大大提高，為科學(xué)研究提供了新的技術(shù)平臺(tái)。
　　本論文擬利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了Nanog-EGFP小鼠胚胎干細(xì)胞系，并以此為報(bào)告系統(tǒng)對(duì)于N2B27中有效的培養(yǎng)成分進(jìn)行篩選。利用熒光顯微鏡觀察，流