利用CRISPR-Cas9建立Nanog-EGFP小鼠胚胎干細胞系及在培養(yǎng)液成分篩選中的應用.pdf

1、胚胎干細胞因其具有體外自我更新以及多向分化的能力，成為研究基因功能、細胞治療和組織再生等的有力工具。近年來，隨著胚胎干細胞技術的發(fā)展及臨床研究不斷取得新的突破，胚胎干細胞在再生醫(yī)學領域的價值越來越為人們所重視。1981年科學家們第一次通過飼養(yǎng)層體系實現(xiàn)了小鼠胚胎干細胞的分離以及體外培養(yǎng)。胚胎干細胞體外培養(yǎng)體系經歷了一個漫長的發(fā)展階段。2008年小鼠胚胎干細胞的N2B27+2iL培養(yǎng)體系被廣泛應用，現(xiàn)已成為大多數(shù)實驗室培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞的

2、首選。盡管這種培養(yǎng)體系可以使小鼠胚胎干細胞在體外很好地維持克隆形態(tài)以及多能性狀態(tài)，但N2B27成分復雜，且成本過高;在不影響培養(yǎng)效果的同時簡化培養(yǎng)液成分，使其組分更加明確，相應降低培養(yǎng)成本是一個重要研究方面。
　　隨著基因編輯技術的發(fā)展，使得包括干細胞在內的多個領域有了突破性的進展。從ZFNs到TALENs，再到CRISPR/Cas9;從最初由蛋白進行識別到核酸酶的識別，基因編輯技術的發(fā)展日新月異。近年來，CRISPR/Cas9技

3、術的發(fā)展使得基因編輯研究進入了一個新的時代。它利用sgRNA對DNA特定位點的識別以及Cas9蛋白的DNA酶活性，使DNA雙鏈產生斷裂。DNA雙鏈的斷裂誘導細胞啟動同源重組機制的基因自我修復，使得基因敲除和基因重組的效率大大提高，為科學研究提供了新的技術平臺。
　　本論文擬利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建了Nanog-EGFP小鼠胚胎干細胞系，并以此為報告系統(tǒng)對于N2B27中有效的培養(yǎng)成分進行篩選。利用熒光顯微鏡觀察，流