雞胸腺素β-,4-串聯(lián)體融合表達(dá)載體的構(gòu)建及原核表達(dá).pdf

1、胸腺素β4（Tβ4）是由43個氨基酸殘基組成的多肽，最初從牛的胸腺中分離得到，隨后發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)其它組織中也有分布。Tβ4是動物細(xì)胞內(nèi)一種主要的肌動蛋白調(diào)節(jié)分子，既不是生長因子，也不是細(xì)胞因子，但會對受損組織的再生、重塑和愈合起重要作用。此外，研究還證實Tβ4參與調(diào)節(jié)上皮形成、血管生成、抗炎等過程，并可促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合，可用來治療感染引起的內(nèi)毒素性休克及伴隨的多器官功能衰竭，在醫(yī)學(xué)中具有重要意義。雖然Tβ4有著廣泛的應(yīng)用前景，但由于其分子太

2、小，難于直接在大腸桿菌中表達(dá)。目前國內(nèi)用于實驗室及獸醫(yī)臨床上使用的Tβ4多為化學(xué)合成品，價格昂貴；而從動物組織中提取Tβ4，過程復(fù)雜、產(chǎn)量低，成分是多分子小肽混合物，存在著治療效果差，副反應(yīng)嚴(yán)重等諸多問題，使其應(yīng)用受到限制。
　　 本課題利用大腸桿菌偏愛密碼子，人工合成雞Tβ4全長基因，結(jié)合PCR技術(shù)變換TB4基因的酶切位點，構(gòu)建雞Tβ4串聯(lián)體基因克隆載體PMD18-2Tβ4；將重組克隆Tβ4基因轉(zhuǎn)化入原核融合蛋白表達(dá)載體PET

3、32a（+）中；再將重組表達(dá)載體PET32a（+）-2Tβ4轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，獲得高純度的Tβ4蛋白，并采用高效液相色譜和Westernblot對其進(jìn)行檢測和鑒定，通過脾淋巴細(xì)胞增殖實驗測定其活性；旨在找一種能經(jīng)濟(jì)、簡便獲得Tβ4活性蛋白的方法，為雞Tβ4制劑的研究和胸腺素在獸醫(yī)臨床的應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)。
　　 結(jié)果表明：
　　 1.采用大腸桿菌偏愛密碼子，合成雞Tβ4全長基因，結(jié)

4、合PCR技術(shù)構(gòu)建了Tβ4的串聯(lián)體克隆載體PMD18-2Tβ4，將其克隆入融合原核表達(dá)載體PET32a（+）中，通過電泳鑒定及基因測序證明融合蛋白表達(dá)載體PET32a（+）-2Tβ4構(gòu)建成功。
　　 2.通過IPTG誘導(dǎo)，PET32a（+-）2Tβ4最適表達(dá)條件為37℃，IPTG濃度為0.5mmol/L。
　　 3.通過SDS-PAGE鑒定表明，Tβ4表達(dá)產(chǎn)物為可溶的，平均每克菌約可得到11.3mg目的蛋白。經(jīng)液相色譜分析

5、，目的蛋白純度可達(dá)95.56％。
　　 4.通過MTT法測定所表達(dá)的Tβ4對淋巴細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示添加8μMTβ4組與未添加Tβ4的對照組相比，淋巴細(xì)胞殖顯著增強，p<0.01。表明所表達(dá)的Tβ4可刺激淋巴細(xì)胞增殖與分化。
　　 總之，本研究通過基因工程方法人工體外成功表達(dá)雞Tβ4蛋白，成本低、表達(dá)效率高、純化方法簡單。經(jīng)體外活性檢測證明，表達(dá)的重組Tβ4具有與天然Tβ4相似的生物學(xué)活性，但其具體的生物學(xué)功能及